上海市进口水果市场病害的检测与病原真菌的鉴定-植物学专业毕业论文

硕硕士位论文答辫委员会成名单姓 名 职称 单 位 备注威华 研究员 中科院上海生命科学院植物生理 主席态研究所仲南 教 授 上海师范大学 委员幼芳 教 授 华东师范大学生命科学学院 委员摘摘要摘 要加入WTO以后大量进口水果进入中国市场在丰富我国人民餐桌水果的同时也加大了外来有害微生物入侵的风险本研究在对上海市进口水果的主要种类产地销售状况进行定期调查的基础上对上海市进口水果市场病害的病原进行了检测与鉴定并重点对进口红地球葡萄携带链格抱属真菌进行了分类鉴定和遗传多样性分析，旨在为今后制定外来有害微生物的预警措施建立长期有效地市场监控机制提供科学依据。1.在2006年9月至2009年3月期间，对上海市各大型水果批发市场、超市、水果零售店进行定期调查表明:上海市全年销售的进口水果主要为来源巧个国家的30个种类共58个品种进口水果的价格普遍高于国产水果销售量最大的为香蕉、葡萄、苹果和橙子，主要进口国为泰国、越南和美国。2.对进口水果市场病害调查结果显示，真菌是引起进口水果市场病害的主要病因。从来源于7个国家与台湾地区的0种水果上共分离得到1株致病真菌。结合形态学与DNAITS序列比拟等分子生物学手段将这些真菌鉴定到属，包括:链格抱属(Ahe胡arasPP)、镰刀菌属护arumpp.)、炭疽病属Coeotiehumpp)灰霉菌属Botyispp)拟盘多毛抱属pstl聊5pp)、芽枝霉属co胡ump)生赤壳属Boneca p旬柄霉e呷yump.、拟茎点霉属Phom叩5pp)、亚隔抱壳属Dirmelap)、青霉属penclumsPp)根霉属(RhzopussP)、黑曲霉(AsPe誉nle:)绿木霉属(动derm“sP)和小穴壳属(DtirlasP)等共巧个属的真菌。3.多种进口水果携带的病原真菌在国内未见报道，如美国红地球携带病原真菌estttopismirsPra，美国黑布林携带病原真菌B妙tssP。4.链格抱属真菌是进口水果中检出率最高的真菌，占进口水果市场病害总检出率的4768%，其次是青霉菌和镰刀菌，检出率分别为457%和n92%。5.从进口红地球葡萄上分离出35株链格抱属Atoara)真菌，反接种鉴定获得14株不同形态且致病性较强的菌株。根据真菌的菌落形态、抱子形态、产抱表型等形态学性状，将这些菌株鉴定为A.atoata、A.tnulsima及A.gaien三个集团种。6.运用ISSR、RAPD分子标记技术对分离进口葡萄和国产葡萄上共39株Ahernara真菌进行了遗传差异性分析，结果表明:外来病原真菌种类与我国/-摘摘要真菌种类在遗传上虽然存在差异来源于美国的菌株与我国有菌株间的遗传距离较近，与智利的较远。本研究概述了上海市进口水果的市场现状初步建立了上海市进口水果市场病害的菌种库同时对重要致病真菌链格抱属真菌进行了分类鉴定及遗传多样性分析，研究结果也将为检疫部门制定进口水果检疫措施提供参考。关键词:进水果;市场病害;链格抱属真菌;遗传样性分析;sR;RApD厂AAbsraCtAbstraCtAtemendousamountofmPoredfeshfushasbeendeveredoChnamaksafrChia5enynohewodadeoganaonWTOneeanghekofnvaonbyhamflPantPahogen.nhsud，hemPored加isweeeguarysuveyedndfeentmakesoexamnevaretesPreesoeaessengeondons，andmaketdseases.naddion，wefoeusedonheeassfeaonanddentfeatonofheAle胡arasPeeesobanedfommPoredgr即esRedGobe，andheirgenetedversywasanayzed.OurresuswlProvdeaseentfeevdeneeforesabshnganefeetvensPeetonandsuPervsonsysemosurveytheoutbeakofhemarketdseasesofhemPoredfusdurngmarketng.1.DurngSePember2006oMaeh2009:oay58sPeeesof30dferentfusweremPoredoShanghaifom 15eountreswhehwhmoreexPensvePree.TheargerProduetswerebananasgraPesaPPesandorangesandthemanmPorerwasThaandVenamandheUnedSaes.2.DurighenvesgaonwefoundhatheimPoredfuisfequentybroughtabouthereatveyserousmarketdseases.OnhebassofmorphoogyandhenucearitenalanbedpaeerTS)ofboomalDNADNA)anay151soaesof15fungigeneaneudngAlernarasPPhrumsPPCOletotichumPPBo妙isPPPsttopsisPPCdosPoumPBonectiaPSenhylumPPhomopsisPPDdymelaPPenclumPPRhopussPAsPe卿10nler，TiehodennasPDothorelasP.whehshownobePahogeneaferhenoeuatonassaywerefnaydentfed.3.SomedentfedPahogensearredbymPoredfuswerenotrePorednChnauehasPestlopssmcosPoradeecedingaPesRedGobe〞eomngfomheUSA)andBotyisP.deeednbaekPumseomngomheUSA)weefrstrePorednChnamarket.4.AmonghedentfedfungAernarawasthemostfequentonewhthehghetdeeeonae4768%foowedbyPencum(457%)and凡aoum(1192%)esPecvey.5.Addtonay，35Ae阴arasPP.weresoaedfom mPoredgraPesRedGobe.Aferhenoeuatonassaywefnayobaned 14sraisWhehshow11仍AAbsaetdfereneenmorphoogyandPahogeney.OnhebassofeoonymorPhoogy，sPoremorPhoogyandsPouaonPaenshese14fungiwerefurherdenifedasA.aernata、A.enussmaandA.gaiensPeeesgrouPs.6.Fnayweanayzedhegenetcdversiyof39Ae阴arasPP.obanedfomgaPesofAmeeanCheandChnawhnersmPeequeneeePeasSSR)andandomamPfedPoymoPhmRAPD)mehod.TheeushowedhatheeexstonyafwgenetedfereneesbeweendferentAernarasransbasedoneuseranayss.GenetedsancebeweensransomAmereanandfomChna5eoserhansraisfomCheandfomChna.ThePresentsudysummarzedhesengsuatonofhemPored加snShanghaimarkesandeonsrueedaPahogensbraydenifedfomhe如Pored加tsdurnghesengPerod.Furhermoe，hemPoratPahogenefungiAernarasPP.werecassfedanddentfedandheirgenetedversywasanayzed.Ourreseareh5veryusefuloofereehnealParameersforChnesequarantnenPeventngannvasonofhefoegnharmfulmeroorgansms.Keywords:mporedfusmaketdseasesAle阴aaspPgeneedves丫ISSRRAPDIV目录目目录目录摘 要I关键词..HAbsract…….……111Keywords……..……V目录…V1采后病害的种类.…111真菌性病害…212细菌性病害…32采后链格抱属Ale。)真菌的危害…321链格抱属真菌的侵染途径…322链格抱属真菌的寄主范围.…423链格抱属真菌的毒素及其危害.…63链格抱属Aleoara)真菌的分类…831链格抱属真菌的形态学特征.…832链格抱属真菌的形态学分类方法..933链格抱属真菌的分子生物学分类方法…104链格抱属真菌的控制方法.…125水果市场病害检疫现状与存在的问题…12正文…巧第一节 上海市进口水果销售与检疫现状调查....……巧1引言…巧2调查方法.…巧21调查形式…巧22调查时间与地点…巧23调查内容.…163结果与分析..…1631上海市水果销售市场的规模及管理现状…1632上海市国产水果销售种类…1833上海市进口水果销售种类…1834上海市国产水果与进口水果销售情况比拟…2035上海市进口水果检疫现状.…214讨论22第二节 上海市进口水果致病菌的分离与鉴定.…251引言....…25目录目录2材料与方法2521病害水果及反接种材料采集…2522方法…263结果与分析2931上海市进水果市场病害的种类…932各检出菌在市场病害中发生的儿率…犯33部分进水果主要致病菌DNATS序列的分析鉴定…犯4讨论.34第三节 进口葡萄携带链格抱属Aena)真菌的鉴定…61引言362材料与方法3721材料.…3722方法…383结果与分析.3931致病性比拟…932病原真菌形态学观察…033DNATS序列分析结果.434讨论45第四节进口葡萄携带链格抱属Ale柳ara)真菌的遗传多样性分析…481引言482材料与方法4821材料…4822方法…493结果与分析5031 isSR遗传多样性分析…5032 RAPD遗传多样性分析…524讨论.54结论与展望……55附录1:常用缓冲液和试剂的配制…57附录2:部分进口水果分离病原真菌的形态特征及反接种症状…59附录3:链格抱属真菌在不同培养基上的菌落形态…75参考文献.……77致谢...…88个人简历…89综综述综 述 果蔬采后病害及其危害水果与蔬菜含有大量的维生素碳水化合物纤维素等营养物质是人们生活中必不可少的食品。由于生产中受到季节性、地域性和产品的易腐性等因素，给果蔬的采后处理贮藏保鲜等环节带来了极大困难特别是在果蔬的生产过程中，由于采摘不当、贮藏不善或由于生理病害、微生物病害的影响往往导致大量果蔬的腐烂损失(高海生等2007)。中国的果蔬产量居世界首位每年果蔬产量超过36亿吨，据联合国粮农组织(FAO)统计数据显示，我国每年生产的水果蔬菜从田间到餐桌，损失率达20%30%，年损失价值近000亿元人民币，而发达国家每年农产品的采后损失率只有17%5%，美国只有%2% (丽泽，2006)。因此探究果蔬采后损失的原因研究高效的果蔬采后保鲜技术是减少增产不增收现象，提高农民经济收益的一项重要举措。新鲜水果和蔬菜在采后流通过程中损失的主要原因可归纳为:生理的(果蔬自身生理衰败)、病理的(病原微生物致腐)、物理的(机械损伤、环境温湿度不适宜)以及三者的协同作用(许玲等2003;张维一等，1996)。然而最终呈现在人们眼前的直观损失几乎均为病理性的腐烂损失而真菌那么是果蔬最主要的致腐病原菌前人对控制果蔬采后生理衰败措施己做了大量的研究报道并制定出诸如低温冷藏气调贮藏减压贮藏等对抑制生理病变行之有效的环境控制措施以及乙烯生物合成抑制剂防止蒸腾失水的涂膜制剂等生理保鲜剂的应用等。随着果蔬采后生理衰老进程得到有效地控制，越来越多的研究者们开始意识到:控制果蔬的损失最终还必须从控制致病微生物导致的采后病害入手如何采用较为简便快速方法在果蔬进入市场流通前就能预测掌握采后致病微生物的侵染途径和致病规律是制定控制措施的重要依据(许玲等，2003)。1采后病害的种类采后病害是引起新鲜水果和蔬菜收获以后在市场流通或贮藏运输过程中损失的病害总称主要分为由病原微生物侵染造成的侵染性病害和由于环境因素不当引起的生理性病害两大类。其中侵染性病害有真菌、细菌。综综述1真菌性病害果蔬采后腐烂主要是由真菌病害引起的引起果蔬采后腐烂的真菌主要是半知菌，为有性阶段还有少数是鞭毛菌、结合菌及子囊菌。常见的果蔬采后真菌性病害主要有灰霉菌(Bo的spp)、青霉(pencumpp)、曲霉A胡e誉uspp)、链格抱Ae二aapp)、镰刀菌(凡aumpp)等。如表l就是部分采后水果的主要真菌病害链格袍属真菌是一类极为常见的真菌广泛分布于世界各地对生态环境及基质的适应性很强大多数种寄生于植物上，引起多种植物病害，少数种腐生于土壤中或多种有机质上，个别种或少数种的某些菌系(株)寄生人或动物上，引起疾病链格抱属真菌形态特征显目易于辨认至属但形态特征易发生变化，因此难于准确鉴定至种(张天宇，2003)。表1部分采后水果主要真菌病害Tabe1ThemaorfngPahogensofsomePoshavestfus水果已报道病原菌文献出处水果已报道病原菌文献出处苹果 川toarasP. 钟国强等， 火龙果 Ase心ilssP. 林正忠等2006;Coleotichump 2005;邓振LJ Bolrlsp. 几beeta2006，Cyo胡orsp. 等，2006 Colttichump. 2007卿lnsPorumP. DrchslraP.勿cPhomasP. FusarumsPP.PhomaP. Sc妙bo妙5sP.香蕉B妙dPldasP刘秀娟等，杨桃AitralasP.何新华Coeoteump. 1995;胡美妓 CldO胡orump.Curulrap. 等，ZOO4 Colorehump凡arumPP. LePo妙ruoPP·Helmnho叩erumsP PhomasPt匆crho阴asP. PhomopslssPP.rPorasPPestlops沽sP.RhlopusspVercumsP.葡萄Aernarap.Tounas&黑布林A胡e馆usp.Eegbe&BankoeAsPe啥5P. Katoudas， Bo恻lIdaP. ，996Bo尽15sP、 2005 CanddasPP曰dosPoru脚sP. 凡arumsPP.FusarumsP Penclu胡sP.Pencliu阴sP. RhopussP.口oeldu脚sP.柑橘Aeoarap.Tounas&番石榴Ascochytap.林尤剑等，1990综综述AsPe誉‘sp Kasoudas， Bo妙ododasP. 罗振海&孔太湖，CldosPoru脚sP. 2005 ColettichumsP. 1990;刘任992凡arumsP. Co理numsP. ，1996;BhargavaGeotichumsP. arumsPP‘ eta，2003;邓PenclumsP. HedernulasP. 丛良等，2006Rh七opussp esll“sp. Keh et a.，Tichoderma sP. PesaltopsssPP. 2006:木瓜 Ale翔arasp 刘秀娟等， R梅octnaP·Bo妙odPldap 1994;成家壮青枣 ColettchumsP. 岑贞陆等2002;CldosPorumsP. &韦小燕，岁ophtorasP 张国辉等，2006Coleo洲chumsP 2000;吴翠萍Co理nesPorasP. &安榆林， 莲雾 价haluosp 莫晓凤等2000;凸卿ulrasP. 2002;张传飞 Colettichumsp 赣荣茂;998凡绍arumsPP. 等，2003; PesaIopsissP，GertchumsP. PoghosyanPerconasP. etal，2004:PhomasP· 谢昌平等，PhomopsissP- 2005;柳tPhtrasP，勺tPlmapRhopussP·TichodennasP-TicholecumsP.12细菌性病害细菌不能直接穿透完整的植物表皮可以通过气孔皮孔水孔等然开孔侵入一般通过生理性或物理性伤害引起的损伤处侵入果蔬采后细菌性腐败的报道较少，常见的有欧文氏菌、假单抱菌、黄单抱菌等。2采后链格抱属Aena) 真菌的危害21 链格抱属真菌的侵染途径链格抱属真菌是果蔬采后一类常见的病原真菌其侵染采后果蔬引起腐烂分为两个时期:采前与采后。211采前侵染:链格抱属真菌是一类优势潜伏侵染菌，在多种水果如甘肃苹果梨(Lital，2007)杏(曹建康2002)哈密瓜(张辉2000)海南番木瓜(刘秀娟994)、综综述芒果(Pukyral，9832002)中均有报道。这类真菌常在采收前潜伏侵染到寄主体内而不发病，在果蔬成熟或衰老，寄主组织的防御能力减弱时迅速生长，引起果蔬腐烂而导致损失关于采前侵染的途径己有较多研究主要是通过然孔口(如气孔、皮孔、花柱、蜜腺等)或伤口(机械损伤、切割损伤等)侵入，或直接穿透植物的角质层侵入。Lila.(2007)对苹果梨黑斑病的侵染途径研究发现病原物最初出现于花尊组织进而侵染花柱及子房组织说明病原物在花期侵入果实其主要通道是花柱。同时链格抱在果实发育阶段可通过果皮组织侵入苹果梨而潜伏在芒果(Pu卿etal9532002)和杏(Laeneral1980)中链格抱抱子或菌丝在果实生长过程中直接由皮孔穿入并且一直潜伏直到果实采收和成熟后在贮运或货架期才发病Altrnariaatrnaa侵染柿子时那么可能直接从伤口或表皮侵入(prkyeza，1981)。212采后侵染:采后侵染主要有三个方面，即采收切割引起的损伤和表面机械损伤导致侵染;生理损伤与表皮衰老导致侵染;在采后处理或与其他物品接触时发生的侵染。果柄处最易发生切割损伤这些损伤对病害的发展有促进作用环境因素如温度、气体酸碱度药害等引起的生理损伤使新鲜果蔬的组织防御能力下降病原菌容易侵入。由于果蔬的衰老，造成其表面蜡质、角质层发生变化，出现裂纹或气孔失去自身调控机能致使链格抱菌乘虚而入通过然开孔侵染引起成熟、衰老的果蔬腐烂链格抱抱子可通过空气传播而采后处理如用水清洗挑选、冷却、化学处理也是造成传染的重要来源(张维一，9%)。22链格抱属真菌的寄主范围链格抱属真菌的寄主范围极其广泛既是一种重要的植物病原真菌又是常见的腐生菌，同时也可作为条件致病菌侵染人及动物:链格抱属(Alernara)真菌是农作物的主要致病菌之一，它能引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨等儿十种农作物发病。其发病机理主要是由病菌的代谢产物—毒素导致的。由于毒素的作用使农作物产生各种症状，如黑斑病、褐斑病、茎枯病、赤星病等等，严重影响了农作物的产量，给我国农业生产带来了巨大损失。美国农业部(UnedSaesDeParmentof综综述Ageuue)真菌寄主索引(usDAFungalHotndx)中，记录了4000多种AltoaraHot的关系依据寄主的数目链格抱属位于近2000种真菌属中的第十位(Farta，1989)。该属真菌种类多，寄主范围广泛，Raabe(981)等曾列举了Hawai地区寄生在番木瓜、番茄、葛芭康乃馨等50多种植物上的20多种链格抱菌A.lni和A.brasca。是世界性分布的种A.Ini可引起马铃薯和番茄早疫病还可侵染花椒、茄子，龙葵等，在我国南、北方均有发生，严重时可造成50%以上的损失(张天宇，2003)。A.b~ ia。是十字花科蔬菜黑斑病的主要病原菌，1988年，大白菜黑斑病在我国华北、东北和西北地区爆发流行，北京市当年白菜损失达20%以上(郑健秋，1994)。999年内蒙古呼伦贝尔市大白菜黑斑病流行，严重地块发病率高达00%，病情指数达615。另外，由A.lngles引起的烟草赤星病，在二十世纪六十年代之前一直是非洲烟草的严重病害五十年代曾在美国爆发流行造成严重损失在我国山东、河南、安徽、吉林、云南、贵州和台湾省烟草上均有发生。2003年，美国在中国出口的鸭梨上分离到一种链格抱菌并以此为理由无限制暂停进口中国鸭梨，给我国造成巨大经济损失(贾月梅，2004)。作为一类常见的腐生菌链格抱可腐生在污水皮革木材纸张纺织品、空气土壤等多种基质上有些链格抱菌常腐生在其它病原物侵染造成的植物枯死病斑上，起雪上加霜的作用。据报道，链格抱菌作为收获后病原菌，所引起的腐烂造成的损失占农业总产量的2550% (Won&珊newsk，994)。作为条件致病菌链格抱菌还可引起人和动物的许多疾病它们能侵染人的皮肤、眼睛、呼吸道等部位，引起皮肤链格抱病、角膜炎、口腔溃疡、哮喘等，还可引起动物的流涎症、呕吐、厌食肠胃出血等疾病。我国首例皮肤链格抱病是1990年由雷鹏程等报告(雷鹏程等，1990)的。近年来关于皮肤链格抱病的研究己有很多(Roberhaw&Hggns，2005;马翠玲，1996;尤海燕，2005;沈永年2002)该属真菌为机会性真菌通常无致病性当患者免疫功能受损、消耗性疾病和长期口服或外用糖皮质激素、免疫抑制剂等可引起发病上述易感因素的人群应高度警惕。北京大学第一医院从人眼病组织中曾分离到A.ae阴ala和A.necoa(张天宇，2003)，杨惠英(2002)、刘维达等(2002)亦对链格抱感染眼部组织引起的角膜真菌病的诊断与治疗做了报道世界范围的综综述流行病研究发现，哮喘病跟A.atrnata存在密切关系(Saota.，2006)。3 链格抱属真菌的毒素及其危害真菌毒素(Mycotxn)也称霉菌毒素，是某些真菌产生的代谢产物或二级代谢产物，前已有350多种真菌毒素(李岩松，2006)。链格抱属真菌多寄生于动植物体内它们是最大的有毒次生代谢产物的生产者之一能产生70多种有毒复合物(Botaico&Logrlco，1998)在农作物新鲜蔬菜水果及人与动物上产生的代谢物已受到越来越多研究者们的关注(李凤琴，2001)。链格饱真菌产生的毒素一方面影响植物体的生长发育引起多种植物病害;另一方面危害人体及动物的健康，因此对链格抱毒素进行系统研究是非常有意义与价值的。231链格抱毒素的种类依据真菌毒素对寄主植物的种或栽培品种是否具有特异生理活性和高度专化作用位点链格抱毒素分为寄主专化性毒素(HsT)和非寄主专化性毒素NHST)两类。链格抱既能产生寄主专化性毒素也能产生非寄主专化性毒素(崔迪，2005)。(l)非寄主专化吐毒素(nonhotpeefeoxnNHsT)非寄主专化性毒素是由病原真菌产生的一类对其寄主植物种或栽培品种具有一定生理活性和非专化性作用位点的代谢物毒素，亦称为非寄主选择性毒素，即NHST。NHST的毒性相对较轻，但作用范围广泛，对病原菌寄主范围之外的植物种类也有毒性它们是植物病害的辅助因素通常能加强病害症状的严重度，起到雪上加霜的作用由链格抱属产生的NHST包括细链格抱毒素tnoxn)、细链格抱酮(enuazonaed，TA)、链格抱酸(aeraaed，AA)、大抱链格抱毒素(maeopoi)、布雷菲德菌毒素A (befdnA)、百日菊链格抱醇(znno)等 (崔迪，2005)。(2)寄主专化性毒素hotpecfeoxiHST)寄主专化性毒素是由病原真菌产生的一类对其寄主植物种或栽培品种具有特异性生理活性和高度专化性作用位点的代谢物毒素亦称寄主选择性毒素即HSTHST的寄主范围相对较窄只对一种或少数几种寄主产生影响它们是引起植物病害必不可少的因素。自Tanaka(933)从日本梨上的菊池链格抱A.综综述kuchana)中发现第一个寄主专化性毒素(AK毒素)以来，至今己从链格抱菌中发现了至少10种寄主专化性毒素:AK、ACT、AAL、AF、ACR·AM、AT、AS、AP及DetuxinB，它们分别引起梨、柑橘、番茄、草葛、粗皮柠檬、苹果、烟草、向日葵、木豆、白菜等植物产生叶斑或茎枯等病害Nhmua&Kohnoo，1983)。虽然它们的作用位点不同，但最终结果都是引致寄主细胞死亡(崔迪2005)如表2为部分植物病原真菌产生HST的产生菌及其致病病害种类。表2 Aheoari属真菌产生HST的产生菌及其致病病害种类Tabe2ThefunglpodueehossPeefeoxnandtpesofpahogenedseases毒素名称产毒素真菌寄主病害AMtxn苹果链格抱叼lerarlamal)苹果轮斑病AKtxn菊池链格抱A.kiuhana)日本梨黑斑病AFtxn 簇生链格抱州Jaccult) 草幕 黑斑病AcRoxin 柑桔链格抱叼.:ti)粗皮柠檬致病型 粗皮柠檬 褐斑病AcTtoxn柑桔链格抱(A.ti柑桔致病型桔褐斑病A-oxin 长柄链格抱(A.1gle烟草致病型 烟草 赤星病ALoxin 链格抱(A.alerat)番茄致病型 番茄 茎枯病ABoxin芸苔链格抱(A.brscae)十字花科蔬菜黑斑病232毒素的提取链格抱毒素的化学本质毒素是低分子量的次生代谢产物其提纯方法要根据毒素的化学性质而定先选择一定极性的有机溶剂进行萃取经过生物测定确定毒素的存在部位，然后采用柱层析、结晶、重结晶、薄层层析制备、高效液相色谱制备、反相高效液相色谱制备、双重串联电极检测设备、气相色谱质谱联机(GCMS)技术等方法，并结合生物测定检测，获得有活性的纯品。毒素纯品的化学结构的鉴定多利用红外光谱图核磁共振图质谱图以及紫外光谱图的数据进行结构的测定(张利辉，2001)。233链格抱毒素对人及动物的影响链格抱毒素可造成植物病害同时对人及动物也有一定的影响如粮食作物、动物饲料中的链格抱毒素可导致癌症甚至死亡人及动物食用被链格抱毒素污染的食物或饲料后，可引起急慢性中毒某些链格抱毒素甚至还有致畸、致癌、致突变的作用。研究者用链格抱毒素交链抱酚(atenail，AOH)、交链抱酚单甲综综述醚(aenaolmonom饰1her，AME)、交链抱烯(aenuene，ALT)喂养小鼠可导致小鼠死亡或提高小鼠的死亡率(Perotal，973);同时几种毒素的混合物较单一毒素的毒性更高(Poockla.，982);互隔链格抱毒素还可能与食管癌的高发率有关(娄振岭，1998)，用AME和AOH处理的人胚胎食管上皮细胞中可检出活化的癌基因(Liucta，992)。234链格抱毒素的应用链格抱菌毒素作为生物资源的利用潜力是巨大的利用它们的特性可开发多种生物资源，如生物除草剂、杀菌剂、筛选优抗病的农作物品种等等。据报道至今有12种链格抱菌己开发或正在开发成除草剂A.helanti对苍耳属杂草的防除效果能达00% (Abbas& Baenne，1995)。链格抱(A.aternaa)对紫茎泽兰(EuPaorim adeoophorum)具显著防治效果，其产生的AAL毒素对杂草有控制作用(AbbaS&Baenne，995)。万佐玺等(200a)利用链格抱毒素开发真菌除草剂来防除紫茎泽兰这种世界性恶性杂草的研究有望使链格抱毒素成为潜在的生物除草剂。一些链格抱的次生代谢物具有杀虫杀菌和杀原生生物活性A.In，的培养滤液中存在抗菌活性物质链格抱酸(川enaicacid)，对黄瓜灰霉病和油菜菌核病的防治效果分别达827%和833% (李树正，1997)。一些研究者还利用链格抱毒素的寄主专化性选育优良抗病品种(万佐玺b，2001)。3链格抱属Aen)真菌的分类31 链格抱属真菌的形态学特征链格抱属是半知菌亚门丝抱纲丝抱目暗色抱科的真菌，其分布广泛对环境与基质的适应性强，既是重要的植物病原真菌又是常见的腐生菌链格抱属真菌属的形态学特征可概括为:分生抱子梗不分枝或有分枝，直或弯曲单生或簇生从菌丝上生出或生于简单的子座上;产抱细胞以内壁芽生孔生式(ebtct)产抱，随着连续产抱作合轴式延伸，抱痕清晰可见;分生抱子卵形、倒棒状、倒梨形或椭圆形，脐部明显;分生抱子褐色或黄褐色，表面光滑或综综述具疵刺具有假设干横隔及纵斜真隔膜，分隔处平滑或明显隘缩。多数情况下抱体至顶端渐窄无缘、具短咏、柱状或丝状长咏。咏分隔或不分隔，色泽明显比抱体淡，有时分化为分生抱子梗(假咏)，产生次生分生抱子，形成短的或长的，简单的或分枝的抱子链，由此形成不同的产抱表型(ounpt)其菌落特征为:在PCA上，25℃培养7天菌落直径达3gcm，生长快速，菌落平展致密或疏松的绒毛状初时菌落灰白色，后变为深色青褐色，由于产生色素的缘故背面常为褐色至黑色(张天宇2003)本属真菌易与Semp勿hum，胡um，im二，Emea，Gb90等属混淆，特别是Aena，ep妙um切cum 三属可根据分生抱子梗及分生饱子的形态(Smmns，1967)与分子生物学技术(por&Bgeow，2003)加以区分。32 链格抱属真菌的形态学分类方法链格抱种级形态学分类主要依据分生抱子形态和产抱表型。分生抱子的形状、大小、分隔、颜色、表面纹饰、咏的有无及形态以及产抱表型(poruaionPaten在一定条件下单支分生抱子梗上连续产生分生抱子后的总体外观形象)是链格抱种的主要分类标准;菌丝特征菌落特征、分生抱子梗的形态、寄主范围等是种级分类的辅助依据要准确鉴定链格抱种必须在依据主要标准的同时综合考虑其他标准(张天宇，2003)。链格抱属级特征醒目而其种间变异较大容易区分至属而不易区分至种。同时其形态容易随培养条件的变化而变化(Leech1962)而一些小抱子种之间，在同种培养条件下形态特征有趋同现象(RobrSta.2000)给分类工作带来很大的困难。Smmons提出只有在一致培养条件下对链格抱进行研究和比拟分类研究才能有较大的进展。SimmonS总结出适合于链格抱小抱子种分类研究的实验条件:用三种培养基(PCA，草琼脂，V-8培养基)在2025C，冷光源白光加近紫外光光照8黑暗6h循环条件下培养，50倍体视镜下观察产抱表型，用乳酸作浮载剂，700倍显微镜下观察抱子及抱子梗。他对500多种链格抱进行研究与比较后比较明确地提出6种产抱表型的特征用于链格抱的种级分类:GouPI由510分生抱子形成短至中等长度的抱子链，分支无或很少，与GoupZ相比，链稍微综综述倾斜。Gro叩2由510分生抱子形成短至中等长度的抱子链，比GouPI粗壮，不分支。Gro叩3分生抱子梗长，其上形成树状分支的分生抱子链，分支链短而紧凑。GrouP4分生抱子梗短，其上形成灌木状分支的分生抱子链，分支链长。GrouPS由0巧(20)个分生抱子形成中等长度至相当长的抱子链，分支无或很少，显得细而长。Goup6分生抱子链分支多而松散，分支之间的次生抱子梗长而明显(Smmons&Robers，1993)。张敬泽等(1997)对培养条件进行了改进，用PCA培养基，12h白光加近紫外光Zh黑暗交替培养7天然后对链格抱抱子进行性状观察与测定采用滤纸玻片培养法同样条件培养5天，观察产抱表型。张天宇(2003)经过长期的研究认为对从然基质上采集的菌直接进行研究，一般能够充分表现自身的种级特性，这种分类更为可靠。33链格抱属真菌的分子生物学分类方法链格抱属建立以来，由于形态特征较丰富人们一直用传统的形态特征进行分类鉴定但由于其在不同基质及培养条件下形态变异大特别是一些小抱子种更难区分，因此仅依靠形态特征进行分类己受到很多学者的质疑(Oan&Kohmoo，1992;Roem，1994:Kusaba&TSuge，1995:Andersenela，2001，2002;Peever，2004)。而现代分子生物学技术的发展，对链格抱与形态相近属间的区分及链格抱种间的分类起到了很大的推进作用归纳近几年应用于链格抱分类的分子技术主要有两类:一是基于DNA序列分析发展起来的特异性位点分析，如DNAITS序列分析(por&Mehades，2002;Qu盯〞meral，2005;Kandameza，2009)、IGS(Hongetal，20O5a;Laehela.，2008)、gPd(Pryor&Bgeow，2003:Pakeral，2008)、mSSU(pryor&Bgeow，2003:Paketa，2008)、Atal(Hongeral，2004;Hongera[，2O05b:)、mLSU(P卿r&Bgeow，2003;Peever，2004)endopG(Peevereral2002;Peever2004)H4位点(Hongeral2006)、微管蛋白(beaubun)基因序列(Peever2004;Quayymetal2005;Paketa2008)及一些不知名的位点这类分子方法的原理是不同属种的基因组中含有一些特异的保守区段，通过测序比较这些保守序列的差异性对真菌进行分类。综综述前应用较多的是DNAITS序列分析，ITS是介于185DNA585DNA和285DNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，已有的研究表明ITS在真菌的种间存在着很大的变异而在种内却高度保守可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息(刘春来2007)可用于链格抱属间的分类(Pryor&Mchades，2002;pror&Bgeow，2003);也可根据TS序列的不同设计特异性引物用于检测(Mckayota，1999);可通过同源性比拟对链格抱属种进行鉴定(Quyyumeta2005)但是利用DNA-ITS序列分析进行分类鉴定也存在一些局限性，如某些小抱子种遗传距离很近，不易区分。二是基于DNA片段多样性的遗传多态性分析，如限制性片段长度多态性(ReconFagmentLenghpoymophm，盯LP)分析(pyor&Mehades，2002)，随机扩增多态性DNA(RandomampfedpoymopheDNARApD)分析(peeveretal2002;Robers2008)扩增片段长度多态性(AmpfedFagmentLenghPoymophm，好Lp)分析(Boeketal，2002;Matizeta，2004;Hongetal2006;Gannba2007;Robers2008)，微卫星DNA(meoaeieDNA)分析(TranDnh2006;Teakam2007)及由其发展起来的简单序列重复(nesmpeequeneeepeat，SSR)(Hongetal，2006;pakeral，2008)。这类分子技术的原理是一个基因组内存在着很多相同小片段利用这些小片段设计引物进行PCR扩增可以得到一系列大小不一的DNA片段凝胶电泳可以使这些片段分开得到一个多样性的DNA电泳图谱，应用聚类分析计算属种间的遗传距禺。应用较广泛的有RAPD技术RAPD 分析以其快速简便分辨率高等特点，已被许多研究者用于研究链格抱相近种或集团种之间的研究(Cooketa1998;MoSela一2000;Roberseta，2000;Pror&Mehades，2002;王洪凯，2003;Sun，2008)然而，该方法存在着重复性差，人为因素影响大等原因使其遭到一些学者的质疑(Peezta.，1998)。刘开启等(2004)对杏果实的黑斑病菌及其他5个链格抱Alernara)相似种共28个菌株的基因组DNA进行了多态性分析，结果表明各菌株DNA片段谱带数差异不明显，不同引物扩增同一菌株的DNA片段谱带数差异也较小，表明链格抱属种间的差异并不全部明显反映在DNA片段谱带上;因此，仅根据DNA片段的图谱特征，难以将各供试菌株明ll综综述确分开。综合使用几种分子标记有时会出现某些种分类混乱的现象，由分子生物学分析所划分的遗传组群与依据形态划分的结果并不完全吻合(Por&Mehades，2002;Hong，2006);同时一些小抱子链格抱种其遗传距离较近，利用分子生物学的方法不易区分因此在进行形态学分类与几种分子生物学技术同时使用，可使分类更准确、更有说服力。4链格抱属真菌的控制方法防止链格抱真菌对农作物的影响要创造不利于真菌而而有利于农作物生长发育的条件一方面可以选择对链格抱有抵抗力的农作物品系，由于不同农作物以及同一作物的不同品系对链格抱的易感性不同因此易感品系作物不适宜在某些地区种植(李凤琴2001)。在农作物被污染之前可以采取一些措施，如喷施一些对人家畜无残毒的高效杀菌剂或用生物防治法或采取以毒攻毒的生物菌及其代谢产物抗菌剂等，预防与杀死有害真菌的繁殖(崔迪等2005)。另一方面要严格控制农作物的运输及储存过程其首要措施是改善运输和存放条件，要经常对运输工具及贮藏场所进行清洁、消毒，保持通风。防止链格抱真菌对粮食饲料的污染首先保持干燥不仅贮藏环境要求干燥，粮食饲料等在贮藏前也要晒干、烘干;要保持粮食加工场所及设备的清洁卫生;要合理添加防霉剂所有加工的饲料都得添加适量的防霉剂尤其是储存时间长的饲料这样才能抑制饲料中霉菌生长防止真菌毒素的产生(王红星&陶正国，2000)链格抱对人及动物的危害也是巨大的，因此对于免疫力低下等一些易感人群，应引起高度警惕，出现可疑皮损应尽早作真菌学检查，及时治疗。5水果市场病害检疫现状与存在的问题市场病害(maketdieae)是指新鲜水果和蔬菜在销售过程中，由病原微生物引起的腐烂和物理因素引起的机械伤害药害等病害的总称(永田英明984)。随着食品安全控制体系的日益完善病原微生物作为新鲜水果和蔬菜采后市场流通中的危害因子己列入了HACCp体系hazadanay5andeealeonolpontsysem的检测与控制范围(宇田川俊一2004)。自2001年11月中国正式加入综综述世界贸易组织(WTO)以来，越来越多的进口水果涌入国内，在丰富我国鲜果市场的同时这些水果携带的包括病原菌在内的有害生物流入我国的潜在机率也在迅速提高加强外来有害生物的检验检疫是保护我国生态安全国民健康以及保护本国农业生产的重要措施。新鲜水果含有高浓度的糖份和其他营养物质，有适合微生物生长的理想的水活性，同时其较低的pH值特别适合真菌生长，果实易潜伏多种真菌而肉眼不易检出采后水果病害导致显著的经济损失此外如果侵染真菌为产毒菌或者致病菌可能会对消费者的健康带来危害。前，己在病害水果中分离到产毒真菌(卿al&Pezr，952:Snonta，980，981)，某些真菌在冷藏条件下依然会产生毒素oas&k，20。另一方面，致病性真菌可以感染部分比拟敏感的水果(Kuup，2003;Lewsezal，1975;Mono，2004)。上海市现有人口1800多万(上海市统计局)是中国最大的水果消费市场之一除少量水果如葡萄草葛和桃等为上海市产外绝大多数水果为外地水果。上海市为中国水果进口的第二大口岸年进口水果达10万多吨仅次于广东(农业部2007)上海市的进口水果除从其他国家与地区直接进口外还有很大一部分从广东、浙江等地中转而来，从而扩大了上海市的进口水果销售市场然而上海市进口水果市场病害较为严重，由市场病害造成的损失不容忽视。我们前期对上海市进口红提葡萄的市场病害进行检测报道了从来源于美国和智利的健康葡萄组织中检出链格抱属(Alernara即)、灰霉菌属(B抑tspp)、芽枝霉属(cdo胡oump)、甸柄霉(Se呷匆lump)4个属共32株潜伏病原真菌，此外还发现进口红提50伤害严重，最高发生率可达92%。(朱颖莹等，2007)。水果内潜伏着多种致病力较强且会产生毒素的真菌，如曲霉属(AsPe誉、镰刀菌属(凡arun和链格抱属(Aleoarla)真菌等。这些真菌潜伏在水果组织内，肉眼不易检出进关检疫时很容易被忽略一旦环境条件适宜，就会迅速生长，导致水果腐烂，产生毒素，导致经济损失的同时，也会危及人体健康进口水果中潜伏携带的病原真菌种类也增大了生物入侵的儿率因此，在完善各项检疫措施的同时加强果蔬进关后的后续管理工作即对进口水果的市场病害进行检测与监督，掌握进口水果市场病害的分布状况是十分必要的。本研究对上海市进口水果进行了市场调查内容包括上海市进口水果的销售l3综综述及检疫现状并对上海市进口水果的市场病害进行了检测分析初步建立了市场病害的菌种库研究结果可为今后制定更加完善的检疫制度提供技术参数同时，从形态学与分子生物学角度对进口葡萄的重要致病菌链格抱属真菌进行了分类与鉴定摸清进口葡萄携带链格抱属真菌的分布为更好的防止微生物的入侵奠定基础。第第一节上海市进口水果销售与检疫现状调查正 文第一节 上海市进水果销售与检疫现状调查1引言上海市是中国最大的水果消费市场之一，年消费水果15060万吨，进口水果的消费量达到巧万多吨其中由上海市直接进口的水果有10万多吨还有很大一部分进口水果从浙江广东等地中转而来。2001年12月中国正式加入世界贸易组织(wordTradeoganain，简称wTO)以来，进口水果的市场份额逐年增加进口水果大量涌入中国市场一方面丰富了水果种类满足了消费者的需求，刺激了果品贸易企业的发展另一方面也给本国水果市场带来了巨大的冲击及时把握进口水果的市场动态了解进口水果的销售状况及检疫现状可为上海市水果生产和经营部门调整水果市场结构防止进口水果传带有害生物和有毒有害物质，保护我国农业生产、生态安全和人体健康提供科学依据。2调查方法21调查形式(l)直接市场调查，定期走访上海市各大型水果批发市场超市、水果零售店;(2)官方数据，查阅上海统计网(hp~ ahgovc20oshjidxap)、中国农业部(ht:/WWWagfgovc可)中国商业部(ht:/WW mofomgovc可)、中国统计局(ht:~ asgovc可)、联合国粮农组织(ht:/fosafoo留)、海关统计资讯网(hp恻whgtenCuomssa/Defuapx)等官方网站;(3)走访上海市进出境检验检疫局、果品行业协会;(4)查阅文献资料，如中国海关统计年鉴;(5)其他来源，如广播、新闻等。22调查时间与地点调查时间:2006年8月2009年3月，每月一次定期走访。调查地点:(l) 上海市出入境检验检疫局第第一节上海市进水果销售与检疫现状调查(2) 上海市果品行业协会(3) 果品批发市场4) 超市(5) 水果零售店(6) 街头摊贩23调查内容采用记录、拍照、调查问卷等形式对上海市进口及国产水果的种类、价格、来源(产地)、销售情况、损耗情况及原因、进口水果检疫现状等进行调查。同时对上海市进口水果市场病害的主要种类，进行检测与分析。3结果与分析31上海市水果销售市场的规模及管理现状311上海市水果销售市场的规模上海市作为中国最大的水果消费市场之一其水果销售市场己形成一定的规模，并且随着人们生活质量的提高，水果的年销售额也逐年递增。前，上海市水果销售渠道包括批发与零售。水果批发主要集中在一些水果集散中心前上海市果品市场基本上己形成五大水果集散中心即曹杨路地区水果集散中心(包括山华三友宏益利民、北海果行等);浦东北蔡上海农产品中心批发市场区域水果集散中心;中山西路、宜山路地区水果集散中心(包括华中果品交易中心、中山西路果品市场海果品配送中心);十六铺地区水果集散中心(含关桥、南浦等批发市场);龙吴路地区水果集散中心(包括上海龙吴果品有限公司在内的10多家果品配送企业、景明路上的华渊果品配送)己经存在但不具各规模的有:上海广粤路水果市场、上海大场水果市场上海龙上农副产品综合市场以及正在扩建中的上海江杨农产品市场郊区的水果市场比较有影响力的是松江的茸南水果市场嘉定的菊园水果市场。全市现有水果批发及其配送企业个数在30家左右(袁亚祥，2008)。水果零售遍布上海市各个角落包括农工商、家乐福乐购华联等大小型第第一节上海市进水果销售与检疫现状调查超市具规模与不具规模的水果零售店及不设常点的水果摊零售点水果来源有两个，一是水果批发市场，另一就是直接来源于产地。进口水果主要集中在龙吴路地区水果集散中心上海农产品中心批发市场内的进口水果一条街，其他水果批发市场的也有为数不多的进口水果批发商家。龙吴路水果批发市场是华东地区最大的进口水果批发市场上海口岸进境的水果直接运往龙吴，由上海市入境检验检疫局龙吴办事处受理报检及现场检验检疫。上海市的进口水果大多从广东、浙江等地中转而来，只有少部分从美国、中国台湾等地区直接进口。我们从水果行业协会了解到上海果品市场销售额基本上以年5%左右的幅度递增，上海市全市的水果年批发及配送成交额在43亿元左右。近几年，上海的水果销量基本保持平稳全市水果年销售量维持在5060万吨的水平约占全市农产品年供应量900万吨的/6。其中，进口水果的销量不足全市水果年销售总量的10%在15万吨左右近年呈现出明显递增的态势(袁亚祥2008)。312上海市水果市场管理现状上海市水果批发市场管理制度正在逐步完善中政府的宏观调控与水果市场的开放式经营有机结合使得水果市场更加有序水果行业协会的建立也促进了上海市水果市场的发展。然而，仍旧存在一些问题:(l)市场布局不合理，多数水果批发市场均集中在普陀区曹杨路两侧其他区(县)的水果批发市场只有零星分布这给水果经销商与消费者带来诸多不便不仅提高了水果经营的成本而且导致部分经销商去其他省市进货，造成客源外流;(2)经营设施不配套，许多商家没有配套的冷藏保鲜贮存设施且场地较小，草蓦、葡萄等类时鲜水果不易保存，导致较多腐烂;(3)无证经营泛滥，有些商家既无工商部门颁发的许可证也无卫生检疫部门颁发的许可证加上某些从业人员素质较低，强买强卖，克扣斤两的现象普遍存在，安全隐患突出;(4)经营环境脏、乱、差，某些水果批发市场的管理现状令人堪忧:环境卫生恶劣腐烂水果处置不当环境条件的恶劣促进水果的腐烂而腐烂水果因处置不当又反过来污染环境形成一个恶性循环。同时多数水果贮藏库的条件很差缺乏经常性的杀菌消毒容易使新鲜水果产生二次感染。第第一节上海市进口水果销售与检疫现状调查水果零售店和超市作为水果零售的主要渠道也存在较多问题多数零售店在水果销售过程中会及时清理腐烂水果然而某些零售店货架上病害水果出现率较高且一些商家把腐烂情况轻微的水果降低价格继续销售，以减少损失这些不科学的处置方式很容易导致病原菌的交叉感染及恶意病原菌的蔓延对水果市场造成危害和安全隐患，同时也容易人体健康造成危害。(6)市场信息缺乏，未建立上海市上市水果的价格、需求量等信息的信息库，盲目性主导市场，易增加水果经销商与种植者的风险性。32上海市国产水果销售种类根据产地分上海市水果市场销售的水果可分为国产水果与进口水果国产水果又可分为本地产水果与外地产水果。上海本地产水果有柑橘、桃、葡萄、梨及一些产量较小的如蟠桃、草蓦、批把、枣子、称猴桃、石榴、杨梅等。2008年上海市果树面积达到359万亩，果品总产量434万吨，产值48亿元。上海市消费的水果大部分是外地水果接近00万吨种类有苹果、梨柑橘类水果、葡萄、称猴桃、甘蔗;热带水果如香蕉、芭蕉、芒果、龙眼、荔枝、木瓜、菠萝、火龙果、椰子、莲雾、杨桃、油桃、樱桃、榴莲、人参果、腰果、油梨、番石榴、甜蒲桃、菠萝蜜、山竹、柑桔、红毛丹、柠檬等。根据供应时间的长短分可分为时令水果及周年供应水果。时令水果有:桃、杏、李梅、杨梅、枣、草葛杨梅、批把、桑甚、柿子、山碴、石榴等。常年都有且销售量较大的水果有苹果、香蕉、梨等。此外，实施零关税政策及两岸海上直航以来上海市场上台湾水果的种类越来越多台湾水果因其优良的品质及较高的商品化程度而日益受到广大消费者的欢迎特别是节日期间更是成为馈赠亲友的佳品。前上海市场上销售的台湾水果有菠萝、香蕉、番荔枝、木瓜、杨桃、芒果、番石榴、莲雾、槟榔、橘、袖、枣、椰子、批把、梅、李、柿子、桃、柠檬、橙、火龙果、哈密瓜、释迎。33上海市进口水果销售种类2006年9月至2009年3月期间，上海市市场上销售的进口水果有来自巧第第一节上海市进水果销售与检疫现状调查个国家与地区的30个种类共58个品种主要来源于泰国越南美国菲律宾、新西兰智利南非等国家和地区也有部分来源于意大利阿根廷、本等(表l)。销售量较大的有香蕉、苹果、葡萄、橙子、称猴桃等。表112006年9月2009年3月上海市进口水果的销售现状Tabe11ThemaketquoaonofhemPotedfutsnShanghaifom20069o20093水果种类水果商品产地价格销售时期及销售量名 元千克)苹果 红蛇果 美国、智利 1822 全年供应，大量青苹果 印度 1418 季节性供应中量青蛇果美国、智利2632全年供应，大量姬娜果美国、南非、智利2226全年供应，中量红玫瑰美国2832全年供应，少量富士苹果 日本 3040 季节性供应，中量牛油果 牛油果 美国、墨西哥 60120 较少供应香蕉 香蕉 菲律宾、泰国 68 全年供应，大量皇帝蕉 1824 全年供应，中量红香蕉菲律宾2430较少供应蓝荀蓝苟智利320360较少供应杨桃杨桃美国2428季节性供应，中量番荔枝番荔枝泰国、越南4452季节性供应，少量樱桃车厘子美国、智利200260较少供应柑橘桔子蜜桔南非、澳大利亚2434全年供应，大量类水澳柑南非3240季节性供应，少量果扁柑美国2832较少供应泰桔次桔泰国3236季节性供应，少量青桔泰国1220季节性供应中量橙子 新奇士橙 美国 1420 全年供应，大量红橙脐橙 澳大利亚、新西兰、南非 1618 全年供应，中量夏橙南非1822季节性供应，少量柠檬 柠檬 美国 2026 季节性供应，少量青柠檬 南非、美国、阿根廷 1624 全年供应，大量袖子 葡萄袖 美国、台湾、南非 2024 季节性供应，中量红西袖美国、泰国