土源性线虫病检测技术

土源性线虫病检测技术第1页/共47页2土源性线虫病检测技术疾病预防控制中心第2页/共47页3土源性线虫病的检测主要是采用病原学检查方法病原学检查方法粪便检查法透明胶纸肛拭法生理盐水直接涂片法改良加藤厚涂片法水洗沉淀法（钩虫卵除外）试管滤纸培养法（钩蚴培养）（钩、蛔、鞭）（蛲）饱和盐水浮聚法第3页/共47页4改良加藤厚涂片法又称厚涂片透明法，为粪便定量或定性检查蠕虫卵的方法。是世界卫生组织、我国推荐的，检测肠道线虫虫卵的主要方法。基本原理：利用粪便定量或定性厚涂片，可作虫卵定量检查。经甘油和孔雀绿处理，使粪膜透明，从而使粪渣与虫卵产生鲜明的对比，便于光线透过和镜检。孔雀绿则使视野光线变得柔和，以减少眼睛的疲劳。第4页/共47页5一、材料和试剂透明液配制方法：取蒸馏水100mL、纯甘油100mL、3％孔雀绿（或亚甲基蓝）1mL，按此比例混合均匀。也可不用孔雀绿或亚甲基蓝。亲水性透明玻璃纸预处理方法：取厚40μm的亲水性透明玻璃纸，剪切成大小为25mm×40mm的长方形，置于配制好的透明液中浸泡24h以上备用。尼龙绢网

80目的尼龙绢网，裁剪成5cm×5cm大小备用。第5页/共47页6一、材料和试剂塑料定量板

规格为30mm×40mm×1mm的聚苯乙烯模板，中央孔为圆台形，其短径为3mm，长径为4mm，高1mm，容积为38.75mm3。软性塑料刮片

规格为两头刮片型或一端刮片型，长60mm，宽6mm，厚2mm。载玻片

规格为75mm×25.5mm，厚1.0mm～1.2mm。其它镊子、剪刀、记号笔、标本盒、吸水纸、光学显微镜、一次性手套等。第6页/共47页7刮填盖压透二、操作步骤第7页/共47页8二、操作步骤（一）用标本盒收集约5g粪样，在标本盒上按顺序编写检验号，并记录好相关信息，每份粪样取1～3张载玻片写上与检验号相同的编号。（二）将80目的尼龙绢摊在粪样上，用刮棒压平后刮取粪便。第8页/共47页9二、操作步骤（三）将定量板放置玻片中央，定量孔小孔朝上，将粪样填满、抹平。约41.7mg细粪渣。（四）垂直向上移去定量板，将亲水玻璃纸抖掉多余水分，盖在粪样上。（五）取另一张载玻片轻压粪样，均匀展开至玻片边缘。第9页/共47页10二、操作步骤（六）待加藤片透明后镜检。粪膜置于30～36℃温箱中约半小时或室温25℃约1小时左右粪膜透明，无水雾后，即可镜检。（七）镜检：将透明后的加藤片置于光学显微镜的载物台上，在低倍镜（100×）下进行镜检，仔细检查每一张片的每一个视野，必要时用高倍镜（400×）作进一步鉴定，及时在原始记录表上记录观察结果。第10页/共47页11覆盖筛网刮取粪液示教第11页/共47页12在定量孔上填上粪液示教第12页/共47页13盖上甘油玻璃纸示教第13页/共47页14第14页/共47页15用一张载玻片压片示教第15页/共47页16第16页/共47页17加藤片透明示教第17页/共47页18约半小时透明后可镜检示教第18页/共47页19二、操作步骤（八）虫卵计数

1.每张涂片发现的鞭虫卵、钩虫卵全片计数。

2.每张涂片发现的蛔虫卵、肝吸虫卵原则上全片计数，但如果蛔虫、肝吸虫感染度特别高，即每个视野蛔虫卵（肝吸虫卵）多于10个，用定视野抽查法推算全片蛔虫卵、肝吸虫卵数。第19页/共47页20二、操作步骤（八）虫卵计数按下图分布固定抽查10个视野，并算出抽查的10个视野蛔虫卵（肝吸虫卵）的平均数乘以全片的视野数，得到全片虫卵数近似值全片粪膜蛔虫卵（肝吸虫卵）总数。第20页/共47页21二、操作步骤（八）虫卵计数

计算3张加藤片的虫卵数分别为A、B、C，每克粪便虫卵数(EPG)为：(A+B+C)

×8；如只有1张加藤片则应乘以24。（1÷41.7≈24）第21页/共47页22三、注意事项亲水性玻璃纸在使用前需全部浸入透明液中，浸泡24小时以上。刮取粪渣填入定量板必须填满全孔并抹平，压制涂片时尽量使粪便均匀展开至边缘，并避免粪渣溢出。在定量应用中，为提高检出率，有时要求每一样本作3张加藤片。第22页/共47页23三、注意事项粪膜要均匀铺开，不宜过厚。透明时间要适度。如透明时间短，虫卵难以发现；时间过长则虫卵变形，不易辨认。一般在室温25℃、湿度75％下，涂片放置不宜超过2小时（室温35℃时0.5小时即可）；若温度低，空气湿度大，涂片放置时间可适当延长。总之，涂片放置的时间取决于粪样透明度，只要透明了，就应及时镜检，否则透明过度，薄壳虫卵易变形看不清楚，会造成漏检或误判。（例如：钩虫卵检查，透明时间宜短，不要超过30分钟。）第23页/共47页24适用范围：适用于人体蠕虫卵的定性和定量检查，定量只适用于钩、蛔、鞭虫卵及其他吸虫卵的检查。优点：方法简便，操作过程中虫卵不会散失，检出率比直接涂片法高。不足：过硬和过稀的粪便不宜使用本法。泡沫状的粪便会在玻璃纸下形成许多微小气泡，妨碍镜检。第24页/共47页25透明胶纸肛拭法第25页/共47页26一、材料：市售透明胶带（宽约2.5CM）、载玻片、牛皮纸、圆底试管第26页/共47页27透明胶带纸粘贴载玻片第27页/共47页28

载玻片透明胶带纸规格第28页/共47页29操作步骤：1.从载玻片上取下透明胶带纸第29页/共47页30操作步骤：2.将无胶的一面紧贴试管圆底，

让有胶的一面裹在外第30页/共47页31操作步骤：3.用裹在试管圆底外的透明胶带纸

在肛周左右转动粘压第31页/共47页32操作步骤：4.在肛周粘压后，从试管上取下透明胶带纸，两端拉紧，

让中部透明胶带纸（有胶一面）覆回载玻片，如不平用试管盖压平

第32页/共47页33三、注意事项于清晨受检者未排便、未运动时进行检查，时间不宜超过早上8点。检查前不要清洗肛门，以免影响检出率。操作过程中，要尽量暴露受检者肛门及附近皮肤皱褶，特别是肛周3点及9点钟处，以利粘着虫卵。第33页/共47页34

本方法主要用于检查线虫幼虫和鉴别美洲钩虫和十二指肠钩虫的幼虫。(一)材料锥形离心管（长11.5cm、管口内径1.5cm）。试管架、吸管、载玻片、盖玻片(20×20mm)、小镊子、滤纸条（宽度略大于试管直径，长度略短于试管，约9.0×1.6cm，滤纸条要用剪刀剪，防止毛边）显微镜、温箱、解剖镜或放大镜、竹签、旧报纸、橡皮筋。

试管滤纸培养法：第34页/共47页35

培养钩蚴材料：第35页/共47页36

(二)步骤1.每管内加入冷开水约2ml。2.将滤纸条沿长轴纵折，以保持挺直。3.用竹签取0.5g粪便，涂于滤纸中段，左右各留0.5cm，上下端各留2cm空白，不涂粪便。第36页/共47页374.将涂布粪便的滤纸插入管中，但不应该接触管底，滤纸条插入管中的深度以水只接触纸条而不碰到粪便为度。第37页/共47页385.在培养管上贴上标签并写上受检者的姓名和编号6.每10管用橡皮筋扎住，上下均包以旧报纸，再用橡皮筋扎紧。

第38页/共47页397．将培养管置于31℃温度中培养4天，或置于26～30℃温度中培养6～8天。以保证所有幼虫都有足够的时间发育到感染期幼虫。

第39页/共47页408.分离幼虫：沿管壁加入约45℃温水，淹没滤纸上的粪便，0.5小时后用镊子轻轻取出滤纸条，弃去。将培养管静置1小时，用吸管吸去上清液，幼虫留于管底0.5ml或更少的水内。钩蚴：左-美蚴右-亚蚴第40页/共47页419.用放大镜(4×以上)或解剖镜以侧照法检出沉淀物内有无活的幼虫。如有活的幼虫，可先将管底部浸于50-60℃的热水内抑制虫体活动。

10.吸取沉淀物1-3滴于载玻片上，将载玻片置于低倍镜下(10×10)检查，为使可折光的幼虫易于观察，检查时要尽量缩小光圈减弱光线，如需详细辨认幼虫，可加上盖玻片，在高倍镜下(10×40)检查，必要时可用目镜测微计测量幼虫。

第41页/共47页42亚、美钩蚴亚洲钩蚴美洲钩蚴食道矛鞘纹第42页/共47页43丝状蚴鉴别美洲钩虫低倍镜下食管矛明显高倍镜下尾部鞘膜横纹明显十二指肠钩虫低倍镜下食管矛不明显高倍镜下尾部鞘膜横纹不明显第43页/共47页44美洲钩虫鞘膜横纹食管矛十二指肠钩虫丝状蚴鉴别第44页/共47页45亚洲钩蚴和美洲钩蚴生活或固定后的主要鉴别点鉴别点检查法亚洲钩蚴（AdL）美洲钩蚴（NaL）食道矛低倍镜高倍镜不见或不明显可见，透明如丝状明显，呈黑色杆状清晰，二矛前端分叉，矛间隙窄头端高倍镜呈扁平形，中间微有凹陷呈圆形，无凹陷鞘膜横纹高倍镜有时可见，但微细不显著明显，横纹线条较粗肠管形态高倍镜管腔较狭窄，肠细胞颗粒丰富，有折光性，肠管深绿色管腔宽广，肠细胞颗粒少，管腔中央透亮，肠管色浅食道形态高倍镜食道彭大部较少，折光性较弱，无折光带食道彭大部显著，在神经环至食道彭大部腹侧有一细长折光带外形低倍镜和高倍镜细长，似园柱状，自头部至肛门宽几乎相等较粗短似纺锤形，自食道基底部向前及向后渐次狭小虫体色调低倍镜高倍镜深绿黑色虫体半透明，肠管呈绿黑色淡绿褐色或绿黄色虫体半透明，肠管淡绿或绿褐色鞘后端至虫体后端间隙高倍镜较短窄0.0506(0.044~0.058)

较长宽0.0621(0.0