基因工程 第三章

基因工程第三章第一页，共五十五页，2022年，8月28日载体定义分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。第二页，共五十五页，2022年，8月28日载体特点

1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。

2.

至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。

3.

至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞第三页，共五十五页，2022年，8月28日载体种类质粒载体（plasmid)λ噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid)单链DNA噬菌体M13动物病毒第四页，共五十五页，2022年，8月28日

第一节质粒载体一、质粒载体的一般生物学特征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞第五页，共五十五页，2022年，8月28日1.定义:

质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，在蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分子的存在。第六页，共五十五页，2022年，8月28日2.质粒DNA的一般生物学特性（1）分子特性

a构型三种

SC型超螺旋L型线型OC型开环b分子量1-200kb第七页，共五十五页，2022年，8月28日（2）质粒的复制类型

根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型：严紧型1-3个拷贝松弛型10-200个拷贝

第八页，共五十五页，2022年，8月28日（3）质粒的不亲和性所谓质粒的不亲和性（不相容性）是指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现象。第九页，共五十五页，2022年，8月28日（4）质粒的转移性

质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

结合型：可自我转移，大多为严紧型质粒非结合型：不可自我转移，安全，为基因工程中常用。大多为松弛型质粒第十页，共五十五页，2022年，8月28日二、理想质粒载体的必备条件1.天然质粒用作载体的局限性天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒具有分子量大，克隆能力低，拷贝数低，提取难度大，克隆位点有限，编码基因具免疫筛选等不足之处。第十一页，共五十五页，2022年，8月28日2.理想质粒载体的必备条件：（1）分子量尽量小，（2）应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一酶切位点，（3）具两种以上的选择标记基因；（4）缺失mob基因（5）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。第十二页，共五十五页，2022年，8月28日二、普通型载体pBR322pBR322的质粒图第十三页，共五十五页，2022年，8月28日pBR322的构建过程1.PBR322质粒载体的构建第十四页，共五十五页，2022年，8月28日1.PBR322的一般生物学特性

aPBR322大小为4.363kb为松弛型质粒，复制起始点来源于pMB1b四环素抗性基因（Tetr)来源于pSC101c氨苄青霉素抗性基因（Ampr）来源于pSF2124d12种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于Tetr和Ampr中第十五页，共五十五页，2022年，8月28日2.PBR322的优点

a分子量小4363bp

统一规定记数从EcoRI识别位点GAATTC的第一个T为1

b两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。

Tetr

基因内有7个酶切位点，

Ampr

基因内有3个酶切位点，

Ori内有2个酶切位点

插入失活：因插入外源DNA片段而使基因失活的现象c具有较高的拷贝数1000-3000/细胞

第十六页，共五十五页，2022年，8月28日用HeaⅡ消化PBR322使其缺失HeaⅡ的B和G片段，缺失了迁移蛋白基因（mob），增加了安全性3.PBR322的改良第十七页，共五十五页，2022年，8月28日

为了克服EcoRI位点不具备插入失活效应这一缺点，引入具有EcoRI单一酶切位点的Cmlr基因，得到新质粒pBR325.第十八页，共五十五页，2022年，8月28日三、常用质粒载体类型（一）克隆质粒载体

克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。目前常用的克隆质粒载体有pBR322、pUC及其派生质粒载体。

第十九页，共五十五页，2022年，8月28日1.pBR322及其派生的质粒载体

pAT153pBR325

2.pUC系列的质粒载体

一种典型的pUC系列的质粒载体包括如下4个组成部分:(1)pBR322的复制起始点

(2)氨苄青霉素抗性基因

(３)ＬacZ’基因

(４)半乳糖苷酶的氨基端第二十页，共五十五页，2022年，8月28日第二十一页，共五十五页，2022年，8月28日pUC质粒载体的特点:1.具有更小的分子量

pUC8/pUC92750bppUC/18pUC192686bp2.利用组织化学法筛选重组体

3.具有多克隆位点

4.具有更高的拷贝数第二十二页，共五十五页，2022年，8月28日（二）表达质粒载体

表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。

据所表达的蛋白是否分泌到细胞外可分为：非分泌型表达载体（胞内表达载体）分泌型表达载体据所用的受体细胞不同：原核细胞表达载体真核细胞表达载体第二十三页，共五十五页，2022年，8月28日（二）表达质粒载体表达质粒载体与克隆质粒载体的区别在于表达载体必须含有：1.强启动子，2.在启动子下游区和起始密码子上游区有一个好的S-D序列3.在插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，第二十四页，共五十五页，2022年，8月28日

三种表达型载体结构图第二十五页，共五十五页，2022年，8月28日（三）穿梭质粒载体

所谓穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而右在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。第二十六页，共五十五页，2022年，8月28日大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体第二十七页，共五十五页，2022年，8月28日第二十八页，共五十五页，2022年，8月28日（四）多功能质粒载体

这类载体具有多种功能，它可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。pGEM系列质粒载体就是一类多功能载体，如pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4z、pGEM3zf等。都是由pUC系列质粒载体派生而来的。第二十九页，共五十五页，2022年，8月28日第二节λ噬菌体载体

细菌质粒载体为基因克隆提供了快速、简便的方法，但克隆能力在10kb左右。不能满足构建文库等的要求。为此人们把λ噬菌体发展成为一种优良的克隆载体。λ噬菌体是迄今为止研究最为详尽的一种大肠杆菌双链噬菌体。第三十页，共五十五页，2022年，8月28日一、λ噬菌体的生物学特性（一）

λ噬菌体的生活周期

λ噬菌体是一种中等大小的大肠杆菌噬体，由一个包裹着DNA的正二十面体蛋白质头部和一个中空管状的蛋白质尾部组成，属温和噬菌体。

第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日λ噬菌体是迄今为止研究最为详尽的一种大肠杆菌双链噬菌体，噬菌体DNA进入细菌细胞后，可有两种生活周期：裂解周期和溶源周期。环状分子整合到大肠杆菌染色体上，与染色体一起复制即溶源化的过程

λ噬菌体垄断寄主的生化合成机制，产生大量双链DNA分子并包装进入Pro.外壳导致寄主细胞裂解。三个基因CⅠ、CⅡ、Cro产物间的平衡，来决定溶源和裂解。第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日溶源和裂解

λ基因表达分为早、中、晚期，早期产物用于和溶源化竟争而确立裂解周期，中期DNA复制和重组，晚期与包装DNA的蛋白有关。

CⅠ编码的阻遏物形成产生溶源化现象，竟争过程中若CⅠ阻遏物形成受阻，而Cro编码的阻遏物形成进入裂解周期。CⅡ、CⅢ对溶源化的建立是必不可少的，但对维持溶源化不是必需。第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日（二）λ噬菌体的基因组结构和功能

λ噬菌体DNA为环状双链分子，长度为4.85kb,两端有12bp的单链互补的粘性末端左边为5’-GGGCGGCGACCT-3’.

右边为3’-CCCGCCGCTGGA-5’，可结合形成双链区段（COS位点）是包装的必需DNA序列。第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日COS位点的结构第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日（二）λ噬菌体的基因组结构和功能λDNA上至少定位了61个基因形成四个基因簇与基因表达调节有关的调节基因簇、与DNA重组及整合删除有关的重组基因簇、与复制有关的复制基因簇、与头尾蛋白质合成及组装和裂解有关的结构基因簇第三十六页，共五十五页，2022年，8月28日人为将其基因组分为三个区：左侧区：包含外壳蛋白的全部编码基因中间区：非必需区，被外源DNA片段取代后，不影响噬菌体的生命活动右侧区：包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因第三十七页，共五十五页，2022年，8月28日二、λ噬菌体载体的构建

野生型的不直接适用于做基因克隆载体：1.λDNA基因组在而且复杂。其中具有常用RE的多个识别位点（5个BamHⅠ，5个EcoRⅠ,7个HindⅢ等）2.存在包装限制，其只能容纳大小为正常野生型总量的75％~105％的DNA分子。第三十八页，共五十五页，2022年，8月28日其改造有以下几个方面切除DNA的非必需区段，扩大其克隆容量切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的RE识别位点引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生物学防护。第三十九页，共五十五页，2022年，8月28日第三节单链噬菌体载体

M13、f1、fd是一类亲缘关系密切的丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有大小为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子单链噬菌体载体主要是由M13噬菌体发展起来的一类载体。第四十页，共五十五页，2022年，8月28日.优越性aRFDNA（复制型双链M13DNA）如同质粒DNA可体外纯化和操作bRFDNA、SSDNA都能转染寄主，并依实验方法，产生噬菌斑或菌落c单链DNA噬菌体颗粒的大小受DNA多寡制约，因此对它们来说不存在包装限制问题，即可以克隆大片段（6倍M13)d应用单链DNA噬菌体可以测定出外DNA的插入方向e可插入单链DNA分子，可应用Sanger测序，及寡核苷酸的定点突变。第四十一页，共五十五页，2022年，8月28日一、M13噬菌体载体1.生物学特性

单链环状DNA分子大小为6.4kb,通过性须或转染将DNA（+）注入雄性大肠杆菌中，它不裂解寄主，受感染的细胞可继续释放大量新的M13。第四十二页，共五十五页，2022年，8月28日过程

单链DNA即（+）链按基因Ⅱ基因Ⅳ方向转录形成（-）链DNA,转变成双链复制型（RF)，RFDNA可从细胞中分离提取出来，用作克隆的载体，当每个细胞内了100-200拷贝的RFDNA后，变为不对称的只产生（+）。这些+链与细胞内积累的DNA结合蛋白结合形成噬菌体颗粒。第四十三页，共五十五页，2022年，8月28日2.α-互补

aβ—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ’）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZ’(编码146AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ’）均可作为标记基因。

第四十四页，共五十五页，2022年，8月28日bx-gal是一种无色的化合物，β-半乳糖苷酶能将x-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝。因此x-gal可作为β-半乳糖苷酶的一种指示剂。第四十五页，共五十五页，2022年，8月28日

c在M13的IS区插入一个大肠杆菌的lac操纵子片段，它包括基因和起动子β—半乳糖苷酶基因的一部分（lacZ’）以及操纵基因和启动子区域。lacZ’编码β—半乳糖苷酶基因前面的146个氨基酸，称为α–多肽。它能与部分缺失lacZ基因的大肠杆菌突变株（JM101细胞）进行α互补，产生完整的β—半乳糖苷酶。可进行蓝白斑筛选。JM101遗传组成(Lacpro.)LacIqlacPOLac△zlacPOLac△zM13pFF染色体α受体α供体第四十六页，共五十五页，2022年，8月28日利用菌落颜色筛选重组子第四十七页，共五十五页，2022年，8月