基因工程药物的

基因工程药物的第一页，共三十六页，2022年，8月28日宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。第二页，共三十六页，2022年，8月28日一、原材料的质量控制

原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。第三页，共三十六页，2022年，8月28日根据质量控制要求应了解以下特性：⒈明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证；第四页，共三十六页，2022年，8月28日⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；⒊应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；第五页，共三十六页，2022年，8月28日⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。第六页，共三十六页，2022年，8月28日二、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。第七页，共三十六页，2022年，8月28日生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。第八页，共三十六页，2022年，8月28日原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。第九页，共三十六页，2022年，8月28日对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；第十页，共三十六页，2022年，8月28日在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。第十一页，共三十六页，2022年，8月28日培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。

第十二页，共三十六页，2022年，8月28日三、纯化工艺过程的质量控制

产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。第十三页，共三十六页，2022年，8月28日在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。第十四页，共三十六页，2022年，8月28日四、目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。第十五页，共三十六页，2022年，8月28日⒈产品的鉴别常用的鉴定方法:

电泳方法:SDS、等电聚焦、免疫电泳免疫学方法:放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)

受体结合试验高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分析、圆二色谱、核磁共振第十六页，共三十六页，2022年，8月28日⑴肽图分析肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。第十七页，共三十六页，2022年，8月28日⑵氨基酸成分分析

50个氨基酸较理想⑶部分氨基酸序列分析

N端15个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。第十八页，共三十六页，2022年，8月28日

⑷重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定蛋白质浓度测定方法有:福林-酚法、双缩脲法蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤法、SD-SPAGE法第十九页，共三十六页，2022年，8月28日⑸蛋白质二硫键分析测定方法有:

对氯汞苯甲酸法等

5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸法第二十页，共三十六页，2022年，8月28日⒉纯度分析⑴蛋白质含量测定

SDS、等电聚焦、各种HPLC、毛细管电泳⑵杂质①蛋白类杂质残留宿主细胞蛋白采用免疫分析的方法②非蛋白类杂质第二十一页，共三十六页，2022年，8月28日②非蛋白类杂质非蛋白类杂质主要有:病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及DNA。第二十二页，共三十六页，2022年，8月28日常用检测方法：杂质和污染物检测方法内毒素鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白免疫分析、SDS、CE其它蛋白杂质免疫分析、SDS、HPLC、CE残余DNADNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异肽谱、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸肽谱、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽谱、HPLC、质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基SDS、IEF、HPLC、CE、质谱、凝胶过滤第二十三页，共三十六页，2022年，8月28日杂质和污染物检测方法单克隆抗体SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽谱、质谱、CE微生物微生物学检查支原体微生物学检查病毒微生物学检查第二十四页，共三十六页，2022年，8月28日⒊生物学活性测定需通过动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。⒋稳定性考查是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。⒌产品一致性的保证第二十五页，共三十六页，2022年，8月28日五、产品的保存⒈液态保存⑴低温保存⑵在稳定的下保存⑶高浓度保存⑷加保护剂保存⒉固态保存第二十六页，共三十六页，2022年，8月28日第十节基因工程药物制造实例

干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1bα2aα2b等亚型。一、基因工程菌的组建

诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s

的mRNA

逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾

pBR322质粒pBR322质粒加上dA或dC第二十七页，共三十六页，2022年，8月28日第十节基因工程药物制造

实例干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1bα2aα2b等亚型。第二十八页，共三十六页，2022年，8月28日一、基因工程菌的组建诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s

的mRNA

逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾

pBR322质粒pBR322质粒加上dA或dC第二十九页，共三十六页，2022年，8月28日

退火获的杂交质粒转化大肠杆菌扩增杂交质粒筛选抗青霉素但对氨苄用杂交翻译法挑选青霉素敏感细菌克隆含干扰素cDNA克隆将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达第三十页，共三十六页，2022年，8月28日二、基因工程干扰素的制备启开种子制备种子液发酵培养粗提精提半成品制备半成品检定分装冻干成品检定成品包装第三十一页，共三十六页，2022年，8月28日α2b干扰素生产过程1.发酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白冻0.5%酵母提取物0.5%NACl。摇床培养30C，10h，发酵种子。15L发酵罐培养，30C，8h。然后42C，3h。离心去上清。ooo第三十二页，共三十六页，2022年，8月28日

2.产品的提取与纯化湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓缩，SephadexG50分离。经SDS检查。在经DE-52柱纯化。第三十三页，共三十六页，2022年，8月28日三、质量控制标和要求