产气荚膜梭状芽孢杆菌检验

产气荚膜梭状芽孢杆菌检验第1页/共29页目录1、概述2、生物学特性（菌体形态学特征、培养特性和抵抗力）3、毒素与分型4、培养基和试剂5、检验程序6、说明/.../09/uuoeoeoeuoeuuu.html

第2页/共29页1、概述

产气荚膜梭状芽孢杆菌又称魏/卫氏梭菌分布：自然界广泛存在(创伤感染）。易污染食品：动物性食品原料食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量繁殖，菌数可达数10万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及证实试验。第3页/共29页2、生物学特性1)形态与染色

G+(陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为(1－2)μmX(2－10)μm。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。Clostridiumperfringens/research/micimm/index.php/research/Images/SarkerSlide.jpg第4页/共29页/shouyiweishengwu/图片资料/产气荚膜梭菌.jpgwww.uni-ulm.de/.../Diagnostik/Erreger/c_keim.htm第5页/共29页2)培养特性*不严格的厌氧*普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。

*适宜生长温度为37—47℃。*生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。*在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h传种1次，较易分离纯化。

ClostridiumPerfringensToxin/.../agents/AgentsBW_toxins.asp第6页/共29页肝片肉汤培养：－－大量产气，培养5h-6h变浑浊；牛奶培养基中生长：－－能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固产生大量气体，冲散酪蛋白，使其成海绵状。庖肉培养基中培养：－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化。普通琼脂平板上培养：－－15h－24h形成S型菌落，在营养不足或琼脂浓度高的平板上可形成锯齿状带放射条纹的R型菌落。

/course/fsc/441/resulex10.htmlat45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation

。第7页/共29页鲜血琼脂平板生长：

－－菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特征之一。

ClostridiumperfringensbacteriaonabloodagarplateCourtesyGlennSonger,The

University.ofArizonaCollegeofAgricultureandLifeSciences.

：/articles/01_02/Clos...Clostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbenchwww.cat.cc.md.us/.../labmanua/lab16/bloodcp.html第8页/共29页ClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar/articles/01_02/Clos...www.cat.cc.md.us/.../labmanua/lab16/bloodcp.html第9页/共29页

菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的α抗毒素抑制。

*由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化

*本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。www.sat.affrc.go.jp/.../Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养：第10页/共29页3)生化特性

*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，*液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落第11页/共29页*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。/aaa/micro.html第12页/共29页

4）抵抗力

A型与C型菌株的芽胞：耐热性强，煮沸1－3h，繁殖型菌体不耐热。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html第13页/共29页3、毒素、酶与分型

毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。

外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。

酶：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒等。第14页/共29页分型：

根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C，D，E和F六个型。

A型：最常见，引起气性坏疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分离，所以叫卫氏/魏氏梭菌

C型：可引起肠炎。

*对人致病的主要是A、C和F型

*引起食物中毒的主要是A型

第15页/共29页4、培养基和试剂4.1庖肉培养基－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化4.2亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）--能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及

铁盐(含有柠檬酸铁胺)的琼脂中形成黑色菌落；前面分离培养和计数用

（SPS）第16页/共29页4.3液体硫乙醇酸盐培养基（FT）－－大量培养该菌用4.4动力—硝酸盐培养基--无鞭毛，不运动；还原硝酸盐为亚硝酸盐第17页/共29页4.5含铁牛奶培养基

--发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h，5h不发酵为阴性IronMilkMedium.ItisamediumusedinMostProbableNumberanalysisofClostridiumperfringens.Whenplacedat45C,CPisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation(seenintherighttube).Thecoagulationofmilkfatformsaplugtherebyrestrictingoxygen(whichisnecessaryforthisstrictanaerobe).Stormyfermenationusuallyoccurswithin6to8hours/course/fsc/441/resulex10.html第18页/共29页4.6卵黄琼脂培养基

－－检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点（每个平板接种10点以上）的底部及其周围形成乳白色的浑浊带。4.70.1％蛋白胨水稀释剂；4.8硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；4.9革兰氏染色液。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html肉毒梭菌对比第19页/共29页5、检验程序

计数30～300个菌落的稀释倍数活菌计数培养第20页/共29页检验程序—续36℃，18～24h36℃，24h＋46℃,2～5h爆发酵无第21页/共29页6、说明

1．活菌计数培养：1：10稀释的样品用蛋白胨水依次稀释至10-2－10-6倍，取1ml放入2个平板，分别加15mlSPS琼脂，于36℃培养24h，选取长有30—300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。

/course/fsc/441/resulex10.html第22页/共29页2、证实试验

(1)纯培养：由平板上任取10个黑色菌落，分别接种FT培养基，于(36±1)℃培养18－24h，大量繁殖。

(2)菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于菌体中央或近端。第23页/共29页(3)检查动力和硝酸盐还原实验：

用接种环(针)穿刺接种动力—硝酸盐培养基，于(36±1)℃培养24h.--判断有无动力--产气荚膜梭菌无动力；

--滴加硝酸盐还原试剂“甲萘胺液和对氨基苯磺酸液”各0.5ml，观察硝酸盐是否被还原--产气荚膜梭菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。＋（红色）

第24页/共29页(4)牛乳乳糖发酵产气“暴发酵”试验：

取生长旺盛的FT培养液1ml接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴发酵”现象。5h内不发酵者为阴性。－－产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴风雨式发酵”现象，但培养基不变黑。第25页/共29页(5)卵磷脂酶检查试验：用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每块平板至少可接种10点)，于厌氧培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围乳白色的混浊带。第26页/共29页3、菌数计算根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计算1g(m