蛋白质分离技术层析

一、概述

1、定义层析(又名色谱)一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。当前1页，总共86页。分子极性分子大小分子形状离子亲和力分子亲和力吸附能力凝胶层析离子交换层析亲和层析2、物理化学性质间的差异吸附层析当前2页，总共86页。1903年俄国植物学家茨维特发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;1970s早期高效液相色谱法（HPLC)目前气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机联用。3、层析的发展当前3页，总共86页。层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。支持物含待分离物质当前4页，总共86页。气相层析液相层析气-固气-液液-固液-液二.层析技术的分类1.按两相所处的状态分类以气体作为流动相以液体作为流动相当前5页，总共86页。2.按层析的机制可分为吸附层析分配层析凝胶层析亲和层析离子交换层析当前6页，总共86页。定义指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法。原理

在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸（1）吸附层析在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。当前7页，总共86页。吸附层析常用的吸附剂

硅胶碱性:碳氢化合物中性:醛,酮,醌,酯,内酯酸性:酸性色素,醛,酸聚酰胺氧化铝活性炭磷酸钙粉末:吸附力大,流速慢颗粒:吸附力中,流速易控锦纶-活性炭:吸附力弱锦纶66或锦纶6酰胺基团对酚,DNP-氨基酸,醌,羧酸氢键：羟基与羰基唯一用于生物活性物质羟基磷灰石当前8页，总共86页。（2）分配层析——利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。当前9页，总共86页。柱层析进样量大且容易回收薄层层析小量样品，快速，操作简便3.按制备量分类当前10页，总共86页。■层析法的演变过程：圆形滤纸长条滤纸薄层层析(TLC)柱层析容量变大容量更大加展开液当前11页，总共86页。纸层析薄层层析当前12页，总共86页。三.层析的一般原理

1.分配系数

表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度。

溶质在固定相中的浓度CsK=————————————=——溶质在流动相中的浓度Cm⇋特定的温度：常数⇋K大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移动速度较慢。当前13页，总共86页。纯化生物物质的纯度取决于混合物中各组分K值的差异程度。混合物中各组分若K值相差较大,则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。当前14页，总共86页。凝胶层析

GelChromatography凝胶过滤（gelfiltration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（molecularsievechromatography）(Hjertén,Mosbach,1962)排阻层析（exclusionchromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。当前15页，总共86页。一、基本原理

当前16页，总共86页。固定相（凝胶）——三维空间网状结构

Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water当前17页，总共86页。■凝胶层析法：样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出

分子筛效应：分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。当前18页，总共86页。当前19页，总共86页。凝胶层析过程的数理关系

1、柱床体积(VT)

2、洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。3、外水体积（V0）4、内水体积（Vi）5、凝胶干体积（Vg）

当前20页，总共86页。柱床体积VT凝胶干体积Vg内水体积Vi存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。VT=1/4D2h外水体积V0VT=Vg+V0+Vi数理关系当前21页，总共86页。

Ve-VoKd=————Vi6、分配系数（Kd）：特点：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关（2）与柱的长短粗细无关每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd）Ve=Vo+KdVi当前22页，总共86页。(2)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里,最先流出。(3)0<Kd<1Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散

Kd=0

0＜Kd<1

Kd=1洗脱体积当前23页，总共86页。

三.凝胶层析的优点

1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。2.操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。四、凝胶层析的缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。当前24页，总共86页。五、凝胶的结构

与性能

1.葡聚糖凝胶1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）（1）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。当前25页，总共86页。（2）特点：交联度：交联剂越多交联度越大网孔结构越紧密交联剂越少交联度越小网孔结构越疏松化学性质：

稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂,耐热耐碱不耐强酸当前26页，总共86页。（2）特点：Sephadex的分级范围

G10<700G15<1,500G251,000~5,000G-501,500~30,000G-753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000吸水性G类的型号表示每克干凝胶吸水量（ml）x10如G-50每克干凝胶吸水量为5ml。当前27页，总共86页。大孔凝胶工作范围的下限几乎是Sephadex的上限可分离MW40万以上的物质可用来分离核酸及病毒。2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝胶当前28页，总共86页。■各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose当前29页，总共86页。六.其它条件选择

1.柱的选择柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。

2.样品的选择：

量适当,粘度小。3.洗脱液的选择：每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。七、应用1.分离纯化2.脱盐3.测分子量当前30页，总共86页。Elutionvolume(ml)AlbuminNaClDesaltinginasimplecolumn当前31页，总共86页。测分子量

VelogMr当前32页，总共86页。实验：凝胶层析法分离蛋白质当前33页，总共86页。血红蛋白64,480二硝基苯-鱼精蛋白2,000-12,000SephadexG-50孔径1,500-30,000一、原理：Kd=0Kd=1当前34页，总共86页。1、装柱※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；※凝胶不能有气泡和分层现象；※装柱结束后要保持凝胶表面平整。二、操作注意点：当前35页，总共86页。2、加样※使液面和凝胶表面相切，关闭出口；※加样时尽量不要破坏凝胶面；※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。当前36页，总共86页。血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？柱的外水体积和内水体积三、结果要求：当前37页，总共86页。亲和层析

AffinityChromatography

NiPeihua当前38页，总共86页。一、原理亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。寻找配基使配基固定化制成亲和层析柱当前39页，总共86页。基本过程+固相化当前40页，总共86页。++洗脱吸附当前41页，总共86页。解吸+当前42页，总共86页。样品固相化再生当前43页，总共86页。当前44页，总共86页。当前45页，总共86页。酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞常见具有专一性亲和力的生物分子对：当前46页，总共86页。（一）载体的选择1、载体要求：（1）不溶性（2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液体流动性（3）化学和机械性能稳定（4）具备大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蚀当前47页，总共86页。2、常用载体（1）纤维素特点：价廉、来源充足纤维性、非均一性限制大分子的掺入非专一性吸附严重用于抗体和酶的纯化（2）葡聚糖凝胶特点：化学及物理性质稳定多孔性比琼脂糖低当前48页，总共86页。

（3）琼脂糖凝胶浓度商品2％Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝胶浓度越低结构越疏松即多孔性越高机械强度越低当前49页，总共86页。（4）聚丙烯酰胺凝胶（5）多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀耐酸、碱、有机溶剂表面非专一性吸附特点：物理化学性质稳定抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强可供化学反应的酰胺基较多当前50页，总共86页。（二）配基的选择1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被修饰的功能基团当前51页，总共86页。以酶和底物为例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始浓度当L0》E0时KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解离常数E：酶L：底物EL：复合物当前52页，总共86页。（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂载体的排斥效应载体的空间障碍当前53页，总共86页。二、亲和层析分离1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附当前54页，总共86页。洗脱方法（1）非特异性洗脱：改变洗脱液pH值离子强度梯度洗脱（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键（3）专一性洗脱当前55页，总共86页。

已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处用弱酸或弱碱溶液处理4、亲和柱的再生：当前56页，总共86页。三、特点

1、只需一步纯化步骤2、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质当前57页，总共86页。四、应用1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理当前58页，总共86页。实验

分离豌豆凝集素载体SephdaxG50配基葡聚糖洗脱液1mol/LNaCl特异性洗脱液1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖当前59页，总共86页。1mol/LNaCl杂蛋白1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖豌豆凝集素活性检测与兔红细胞发生凝集反应当前60页，总共86页。离子交换层析

ionexchangechromatography当前61页，总共86页。一、原理

离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离子型混合物的层析方法。当前62页，总共86页。低盐高盐分离结束当前63页，总共86页。带电荷不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质当前64页，总共86页。离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力当前65页，总共86页。二、离子交换剂的类型在惰性载体上引入带有电荷的活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂——带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂——带正电荷，与阴离子交换Ø

阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。胶体胶体当前66页，总共86页。1.离子交换树脂：(1)类型聚苯乙烯树脂：（二）按载体种类不同苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母体交联剂当前67页，总共86页。聚丙烯酸—阳离子交换树脂甲基丙烯酸二乙烯苯特点：高交换量pH<8羧基不完全解离当前68页，总共86页。（2）离子交换树脂的性质①、一般离子交换剂的特性多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团②、交换量：指交换剂中可交换的离子数当前69页，总共86页。Dowex100149mDowex50297mDowex20840m③、交联度：合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大树脂的网孔越小膨胀性小交换量少交联度越小树脂的网孔越大膨胀性大交换量大

膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损当前70页，总共86页。阳离子交换树脂

强酸型磺酸基-SO3-H+

中等酸型磷酸根-O-PO2H2

亚磷酸根-O-POH2

弱酸型羧基-COOH阴离子交换树脂

强碱季胺基团[-N+(CH3)3]弱碱叔胺、仲胺、伯胺基团

（3）可引入的解离基团当前71页，总共86页。当前72页，总共86页。（4）离子交换树脂对离子的亲和力■离子取代顺序：++++++++++++++++++>>电荷高者离子大者浓度大者>当前73页，总共86页。（4）离子交换树脂对离子的亲和力①阳离子树脂电价数：Na+<Ca++<Al+++<Ti++++原子价数相同，原子序数Li+<Na+<K+<Pb+②阴离子强碱性交换树脂CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I-<C2O4=<SO4=弱碱性交换树脂F-<CL-<Br-=I-=CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根<柠檬酸根<C2