别构酶及其动力学

别构酶及其动力学第1页/共39页别构效应（allostericeffect）：寡聚酶（蛋白）上一个活性部位的改变通过构象变化影响到其它活性部位的效应别构酶（allostericenzyme)：能产生别构效应的酶。除了有一个活性中心外，还有别构效应剂结合位别构效应剂（allostericeffector)：作用于酶活性中心外的某处，通过促使酶分子空间构象的改变而影响酶的催化。

酶的别构效应可由底物结合引起，也可由别构效应剂结合引起的。第2页/共39页一别构酶及其作用特性(一)概述：别构效应是机体代谢的重要方式代谢调节的方式：迟缓调节:需时间长，几个小时。通过改变酶分子的合成、降解、酶原转化来控制细胞内酶分子浓度。快速调节:时间短几秒或几分钟。对体内现有的酶进行激活或抑制。

调节酶:在体内代谢过程中起快速调节作用的酶包括共价调节酶和别构酶第3页/共39页(二)别构酶作用特性----协同效应(cooperativeeffect)

协同效应：一个配体与蛋白或酶结合后对另一配体结合的影响

1.分类：同种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对后续同种或同类配体结合的影响。异种效应：一个分子的配体与蛋白或酶结合对不同种或不同类配体结合的影响。正协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合可促进下一分子配体与蛋白和酶结合的效应。负协同效应：一分子的配体与蛋白或酶结合使其它配体的结合力降低的效应。第4页/共39页例如:四亚基蛋白（酶）

P+LK1PL1

K2PL2K3PL3

K4PL4

内在解离常数:K1=K2=K3=K4

无协同

K1>K2>K3>K4

正协同

K1<K2<K3<K4

负协同右图中:a为无协同(双曲线)b正协同效应(S形曲线)c负协同效应(表观双曲线)V[S]abc第5页/共39页2.协同效应实例:(1)正协同实例——ATCase（66）

Asp+氨甲酰磷酸

氨甲酰-L-Asp+Pi(过量)ATP产生异种正协同效应：别构激活

CTP产生异种负协同效应：别构抑制

V[Asp]VmVm/2KmappATPCTP第6页/共39页尿素和有机汞处理可选择性破坏酶的效应剂结合位脱敏作用：酶失去了原有的对效应剂的敏感性脱敏后的酶仍然保持催化底物的能力，但不再呈现S形动力学，说明：催化亚基底物结合位调节亚基ATP、CTP结合位①酶有两个结合位点②ATP和CTP两种效应剂可能是结合在同一部位。③ATC酶效应剂结合位的存在对S型动力学是必要的第7页/共39页ATCase的别构效应表现为四级

结构的大幅度变动：

利用ATCase的二底物过渡态类似物：PALA（N-膦乙酰-L-Asp)的研究表明：

ATCase的6个亚基的底物结合位都位于催化链之间的界面上，活性中心相距2.2nm

结合PALA后的酶，催化三聚体彼此拉开1.2nm，同时旋转10º；并使分别位于催化链N-端与C-端的氨甲酰磷酸结合位和Asp结合位彼此靠近，成为高亲和状态一个催化亚基的构象变化通过亚基界面之间的相互作用，传递给另一个催化三聚体，并引起后者构象的转变第8页/共39页(2)负协同效应：3-P-甘油醛脱氢酶：3-P-甘油醛+NAD++Pi

NADH+1,3-2P-甘油酸+H+

半位反应性：该酶为四聚体，但4个活性部位中只有2个起作用兔肌3–P-甘油醛脱氢酶与NAD+结合的解离常数解离常数透析平衡法荧光测定法

K1<10-10M1×10-8MK2<10-9M9×10-8MK33×10-7M4×10-6MK42.6×10-5M3.6×10-5M第9页/共39页(3)协同作用的生理意义：

①异种协同效应:代谢调节,可被代谢末端产物反馈抑制和中间产物的别构激活。例如：EMP的己糖激酶，受G-6-P的别构抑制；丙酮酸激酶受ATP、乙酰CoA的别构抑制，受F-1,6-2P的激活。②同种协同效应:

正协同：提供一个反应速度对底物浓度变化的敏感区，且敏感区可通过别构激活或别构抑制剂加以调整

负协同：提供反应速度对底物浓度变化的不敏感区，保证在低底物浓度时保证反应正常进行，而高浓度时反应平稳第10页/共39页二别构酶的几个动力学概念：(一)S0.5

：表观Km值，在别构酶反应中速度达到最大反应速度一半时的底物浓度

(二)K系统与V系统：

别构效应剂类型：①K型效应剂：只改变S0.5

，但Vm不变②V型效应剂：不改变S0.5

，只改变Vm③K-V型效应剂：

S0.5和Vm都改变VmS0.5Vm/2S0.5VmVmVmK系统V系统第11页/共39页三别构动力学(一)Hill模式:

把研究血红蛋白动力学应用到别构动力学。

E+nSk1ESnk2E+P

k-1

总的解离常数Ks’=[E][S]n

[E0]=[E]+[ESn]

[ESn]

饱和分数：Ys=酶所结合的底物分子数

酶上底物结合位点数

Ys=n[ESn]=[S]n

n[E0]Ks′+[S]n第12页/共39页Hill方程:Log(Ys

)=nLog[S]-LogKs′①

1-YsLog(Ys

)~Log[S]作图

1-YsV=k2[ESn]Vm=k2[E0]V/Vm=[ESn]/[E0]=Ys带入①中得:Log(V)=nLog[S]–LogKs’②

Vm-V

作图直线的斜率为n（Hill系数）

LogKs’/n-LogKs′Log(

V)

Vm-V

Log[S]第13页/共39页当V=Vm／2时，[S]=S0.5

带入②中则：

Log[S]0.5=LogKs′，S0.5=(Ks′)1/n=Ks′

利用Hill模式判断协同的类型：

饱和指数(Rs)或协同指数(CI)

Rs=酶位点90%饱和时底物的浓度

酶位点10%饱和时底物的浓度

90%饱和：V=0.9Vm，[S]0.9=(9Ks’)1/n10%饱和：V=0.1Vm，[S]0.1=(1/9Ks’)1/nRs=[S]0.9

=811/n

[S]0.1

若n=1则Rs=81无协同若n>1则Rs<81正协同若n<1则Rs>81负协同n

V[ESn]

Vm=[E0]=Ys第14页/共39页Hill模式的缺陷:①假设n分子底物和酶的结合一步完成，过于理想化②Hill模式用于研究别构模式时，对四个亚基酶来说n=4，但实际n=2.6~2.8之间。并且在负协同时，要求n<1。所以Hill系数已不能代表酶所能结合底物的位点数。③用Hill方程在一定底物浓度范围内作图是一直线，但在广泛底物浓度下作图时为折线。n=1n=1n>1Log(

V)

Vm-V

Log[S]第15页/共39页(二)MWC模式：Monod-Wyman-Changeux:于1965年提出，也称齐变模式1.模式要点:①别构蛋白是一种寡聚体，由多个相同原体构成。原体是寡聚蛋白最小的功能单位，它们在别构蛋白中占有相等的地理位置。寡聚蛋白至少有一个对称轴。②每个亚基对同一种配体只有一个结合位点。③蛋白亚基可具有R型和T型两种构象。这两种构象在无底物和效应剂存在时处于平衡状态。④蛋白亚基都只能取相同的构象，无杂合体。亚基齐步转变⑤亚基的构象可变，但蛋白分子的对称性不变。⑥无论多少配体结合到酶上，配体与R态和T态酶的内在解离常数都相等，分别以KR和KT表示。第16页/共39页2.MWC解释底物的同种协同效应。以四聚体别构蛋白为例：平衡常数L=[T]／[R]

RKR1RSKR2RS2

KR3RS3KR4RS4TKT1TSKT2TS2KT3TS3

KT4TS4KR1=KR=[R][S]

[RS]=4[R][S]

4[RS]

KRKR2=2KR=[RS][S]

[RS2]=6[R][S]2

3[RS2]

KR2KR3=3KR=[RS2][S]

[RS3]=4[R][S]3

2[RS3]

KR3KR4=4KR=[RS3][S]

[RS4]=[R][S]4

[RS4]

KR4L第17页/共39页同理可求知：[TS]

、[

TS2]、[

TS3]、[

TS4]Ys=[RS]+2[RS2]+3[RS3]+4[RS4]+[TS]+2[TS2]+3[TS3]+4[TS4]4([R]+[RS]+[RS2]+[RS3]+[RS4]+[T]+[TS]+[TS2]+[TS3]+[TS4])

[R][S](1+[S])3+[T][S](1+[S])3=KRKRKTKT

[R]

(1+[S])4+[T]

(1+[S])4

KRKT定义：L=[T]

，C=KR,=[S],C=[S]

[R]

KTKRKT

Ys

=V=(1+)3+LC(1+C)3

Vm(1+)4+L(1+C)4

第18页/共39页若酶结合位点为n，则：

Ys

=(1+)n-1+LC(1+C)n-1

(1+)n+L(1+C)n

讨论:①若S只与R态结合，则KT→∞C=KR/KT=0

则Ys=(1+)n-1

(1+)n+L

假设：n=4，以V~

作图，L越大，S型越明显

可解释底物的同种正协同效应

VL=1L=10L=1000L=100L=10000C=0n=4第19页/共39页②若酶只有一种形式:

只有T态，[R]=0,L=[T]/[R]→∞

Ys=V／Vm=C=[S]

1+C

KT+[S]

只有R态，[T]=0,L=[T]/[R]=0

Ys=V／Vm==[S]

1+

KR+[S]③若KR=KT,则C=1:Ys=/（1+）

=[S]KR+[S]

④若n=1(只有一个结合位点)：Ys=[S]

KR(1+L)+[S]

1+LCYs=

(1+)n-1+LC(1+C)n-1(1+)n+L(1+C)n第20页/共39页3.MWC解释异种协同效应:RLT，设KR<<KT(S优先与R结合)

激活剂A使酶处于R态；抑制剂I使酶处于T态以二亚基酶为例:TKI1TIKI2

TI2

L′

RKA1RAKA2RA2

KA1=KA=[A][R]

[RA]=2[A][R]

2[RA]KAKA2=2KA=[RA][A]

[RA2]=[R][A]2

[RA2]

KA2同理：[TI]=2[T][I][TI2]=[T][I]2

KI

KI2KI:KA，KI:激活剂、抑制剂与酶的内在解离常数第21页/共39页

[I]L′=[T]+[TI]+[TI2]

=[T](1+KI)2

[R]+[RA]+[RA2][R](1+[A])2

KAL=[T],β=[I],γ=

[A]，则：

L′=L(1+β)2

[R]KIKA

1+γ

若结合位点数为n：则L′=L(1+β)n

1+γ

有底物存在时:由于KR

<<KT

,C≈0Ys=(1+)n-1

=(1+)n-1

L’+(1+)nL(1+β)n+

(1+)n

1+γ

第22页/共39页讨论:①若只有激活剂存在，[I]=0时,则β=0:

L′=L／(1+γ)

n<L=[T]／[R]

表明[T]浓度下降，处于有利于和底物结合的R态的酶比例增加——别构激活。②若只有抑制剂存在，[A]=0，则γ=0:L′=L(1+β)n>L

表明[R]浓度下降，处于不利于和底物结合的T态的酶比例增加——别构抑制。缺限:①要求酶的构象变化是齐步的②没有考虑到负协同效应L’=L(1+β)

n

1+γ第23页/共39页ssssssss(三)KNF模式Koshland-Nemethy-Filmer于1966年提出1.模式要点:①对聚合体酶来说，每个亚基可有R和T两种状态，但在无底物和效应剂存在时只有T态。②亚基的构象改变可由于且只能由于配基和底物的结合引起，构象的改变是序变过程，存在杂合体③酶构象的改变只影响相邻亚基的变化，使其他配基的亲和力增加或减小。ss第24页/共39页2KNF模式与底物协同：以二亚基酶为例，酶受到底物诱导可能的构象变化：定义平衡常数：T态

R态

S

+SSSTTTRRR+S

+SS

+

KtKSRKTT

+

KTR

+

KRR

第25页/共39页

由T2TR包含三步：

S

+ST2TR或RTSSR2+S

由TRR2也包含三步：Keq=[R2]=

KtKSRKRR

[TR]

[S]

KTRKeq=[TR]=

KtKSRKTR

[T2]

[S]

KTT

令：KTT=1,[T2]=1

S+S

消失，或生成S

S

或消失，生成S

S+S

SSS

或S

第26页/共39页酶活性中心底物的饱和分数：

总[TR]+2[R2]

Ys=2([T2]+总[TR]+[R2])[TR]+[RT]=总[TR]=2KtKSRKTR[S][R2]=KtKSRKRR[S]

[TR]

=Kt2

KSR

2KRR[S]2

KTR

几率因子=排列方式数=KtKSRKTR[S]+Kt2

KSR2KRR[S]2

1+2Kt

KSRKTR[S]+

Kt

2

KSR2

KRR[S]2

Ys对[S]作图是一条S形曲线1亚基转变2亚基缔合方式3底物与R结合数量4底物浓度项第27页/共39页若KRR=KTR=1，即亚基之间无相互作用，则：

YS=KtKSRKTR[S]+Kt2

KSR

2KRR[S]2

1+2Kt

KSRKTR[S]+Kt2

KSR2

KRR[S]2=KtKSR[S]+Kt2

KSR2[S]2

（

1+Kt

KSR[S]）2

=[S]1/Kt

KSR+[S]——符合米氏动力学第28页/共39页

对于四亚基酶，其亚基排布有三种：

S

S

S

S22

SS22

SS

SS

SS

SSSS

SSS

SSS22

[T3R]=2(KtKSRKTR+KtKSRKTR2)[S]

[TR3]=2Kt3KSR3

[S]3

(KTRKRR2+KTR2KRR)[T2R2]=Kt2KSR2

[S]2

(

KTR2KRR

+2

KTR

KRR

+2

KTR3+KTR2)[R4]=Kt4KSR4

KRR3

[S]4

第29页/共39页

四亚基酶饱和分数表达式：

[T3R]+2[T2R2]+3[TR3]+4[R4]

Ys=4([T4]+[T3R]+[T2R2]+[TR3]+[R4])

S

4

SS4

SS2

SSS4SSSS

S

4S6S

S4SS

SSSS[T3R]=4KtKSRKTR3

[S][T3R]=4KtKSRKTR2

[S]第30页/共39页3KNF模式与效应剂：激活剂与酶结合后，不影响酶继续结合底物；而抑制剂结合到酶分子上之后，使酶的构象发生改变，不再与底物结合——解释异种协同效应以二亚基酶为例。激活剂与底物共存时：

A

+AAA+AS

SSSASAASA

+A++A+ASSA+ASASA+S+S+S+S+S+S+S+S222222A+AKAR第31页/共39页

抑制剂与底物共存：

Kt’C态I+IKIC[RI]=2KtKt’KSRKICKRC[S]

[I]

先求出各种酶形式的浓度，然后带入饱和分数表达式

+I+IS

SS

+S+SI+ISI+S222II第32页/共39页(四)EIG模式:也称为总模式（generalscheme），是1967年由Eigen提出的。要点:①酶无论是否结合配体，亚基的构象都能发生变化②在同种酶分子中不同的构象的杂合体都能依次与底物结合ssssssssssssssssss第33页/共39页四酶的记忆与滞后现象(一)酶的记忆现象：

Rabin模式来解释:E+S

K1

ES慢K