人髂骨生长板软骨细胞的体外培育及鉴定

人髂骨生长板软骨细胞的体外培育及鉴定【摘要】探讨人髂骨生长板软骨细胞体外培育的可行性并观看其生物学特点。［方式］对手术中取得的 10例青青年特发性脊柱侧凸患者髂骨生长板软骨行体外分离、培育，观看细胞形态， MTT法测定细胞增殖，Ⅱ型胶原免疫组化染色，采纳逆转录聚合酶链反映检测各代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达水平。［结果］（1）体外培育的软骨细胞随着传代次数的增加，细胞形态由原代的多角形慢慢变成长梭形；（2）MTT比色法检测显示，第2代髂软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，在第4～8d细胞呈对数生长，在9～10d达平台期，至第11d开始显现生长抑制。（3）第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性。（4）Ⅱ型胶原mRNA表达水平从第2代后随着传代次数的增加慢慢下降。［结论］采纳联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块一起体外培育髂软骨细胞简单、有效，P2代细胞专门好的维持了软骨细胞的特性，能够作为种子细胞来源。【关键词】 软骨细胞 单层培育 物学特性 脊柱侧凸Abstract:［Objective］Toestablishaviableandconvenientmethodforhumaniliacgrowth-platechondrocytecultureinvitroandstudythebiologicalcharactersofthechondrocyte.Method］Thechondrocytesfrom10humaniliacgrowth-platewereculturedinmonolayerandpassagedtoobservethechangesofcellmorphology.ThegrowthkineticswasdetectedbyusingMTTcolorimetric.ImmunocytochemistryandRT-PCRwereperformedtoinvestigatetheexpressionofcollagen

ⅡattheproteinandmRNAlevel,respectively.［Result］(1)Thephenotypechondrocytewaschangedfromoriginalpolygonalshapefusiformat4thpassage.(2)MTTtestshowedthegrowthcurveofthesecondpassagecellspresentedinverted"S",andcells

oftowerefoundlogarithmic

growthat4th～8thdayreachedplatformstageat9th ～10thday,anddecreasedatthe11thday.(3)ThecollagentypeⅡimmunohistochemicalstainingwasextensivepositiveincellsatP2.(4)RT-PCRconfirmedthatthemRNAleveldecreasedwiththecellspassagedafterP2.［Conclusion］Themodifiedmethodoftheenzymatictwo-stepdigestionisaneffectiveandsimpleprocedure.Thesecondpassagecellsmaintainthephenotypeofchondrocytewell,couldbeservingasseedingcells.Key words：chondrocyte;

monolayer

culture;

biologicalcharacteristics;scoliosis软骨细胞体外培育关于研究骨形成机理、 骨骼系统疾病发病机理具有重要的意义，同时也可为组织工程提供种子细胞，是进行骨科相关领域基础研究的一项重要技术。其体外培育受培育条件、取材部位、研究对象年龄等多因数的阻碍，细胞活力、增殖能力、去分化能力不同明显［一、2］。众多研究的取材偏向于年龄较小的肋软骨、关节软骨、鼻中隔软骨等［3、4］。而人髂骨生长板软骨的体外培育，鲜有报导。本实验对软骨细胞体外培育传统方式进行改良，用以培育青青年髂骨生长板软骨，并对其生物学特点进行鉴定，以探讨作为种子细胞的可行性。资料与方式一样资料青青年特发性脊柱侧凸(adolescentidiopathicscoliosis，AIS)患者后路矫形手术时取得髂骨生长板软骨10例，全数为女性；年龄12～14岁，平均岁，Cobb’s角44°～70°，平均°，其中Lenke5例，LenkeⅡ1例，LenkeⅢ2例，LenkeⅤ2例。要紧仪器与试剂DME培育液,Gibco)，胎牛血清(FBS,Gibco)，%胰蛋白酶-EDTA(Gibco),Ⅱ型胶原酶(Gibco)，双抗(青霉素、链霉素)（sigma），Ⅱ型胶原一抗、二抗（北京中杉金桥），DAB显色液(北京中杉金桥)，Trizol Reagent(Invitrogen) ，RT-PCR试剂盒(Invitrogen) ，琼脂糖(Promega)，CO2细胞培育箱(NAPCO)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympus)。细胞分离和培育术中取得的标本置于预装 PBS离心管中，当即送入实验室，在超净台内认真去除软骨周围的韧带及结缔组织，将软骨块剪至1mm×1mm×1mm大小，采纳两步酶消化法%胰蛋白酶-EDTA消化30min、0.2%Ⅱ型胶原酶消化 4～6h)消化后，搜集细胞并计数，台盼蓝实验测定细胞活性后，将未完全消化的软骨块及软骨细胞一起接种于含 10%FBSDMEM培育皿中，在5%CO2培育箱中，饱和湿度、37℃条件下培育，每3～4d换液一次，待细胞近融合时，%胰蛋白酶-EDTA消化2～3min，计数后按1∶3或1∶4传代。观看指标细胞形态学培育的软骨细胞在倒置显微镜下观看细胞形态的转变并照相。MTT比色法测定细胞增殖取P2代细胞计数后接种于96孔培育板中，每孔3000个细胞，别离接种12孔，每孔设3复孔，空白调零孔加ml无血清DMEM，置CO2孵箱中37℃培育，隔天换液。天天掏出3孔进行检测，弃去培育液后，加入200μlMTT溶液，孵育4h，吸去MTT溶液，加入200μlDMSO溶解紫蓝色结晶，振摇5min，置酶标仪570nm波长测定光密度值(OD值)。Ⅱ型胶原免疫细胞化学对P2代细胞用爬片技术，待细胞贴壁后2～3d取下载玻片，PBS浸泡3次，每次10min；3%过氧化氢室温下孵育10min；PBS浸泡3次，每次5min，加丙酮固定30min，PBS浸泡3次，每次10min，10%牛血清白蛋白室温下封锁20min；弃去液体，滴加1∶100的一抗4℃下留宿(空白对照加PBS);PBS洗3次，每次10min;滴加1∶100的二抗，37℃孵育30min;PBS浸泡3次，每次10min;DAB显色(按说明书操作)，苏木素复染，脱水，封片。RT-PCR测软骨细胞Ⅱ型胶原 mRNA表达取P1～P4代细胞，Trizol 裂解细胞，抽提总 RNA，利用Invitrogen 公司的两步法进行 RT-PCR反映，PCR反映条件:94 ℃5min，94℃45s，60℃30s，72℃45s，循环30次，72℃延伸10min，4℃终止。Ⅱ型胶原(colⅡ)，β-actin引物序列和扩增产物大小见表1。将PCR扩增产物进行电泳。采纳Smart-view2001生物电泳图像分析系统对电泳条带灰度值进行半定量分析。统计学处置实验数据用x-±s表示。采纳SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采纳单因素方差分析 (ANOVA)和t 查验，P＜为不同有统计学意义。表 1ColⅡ和β-actin 引物序列和扩增产物大小 SenseprimerReverseprimerProductsize(bp)Col Ⅱ5′-TCCCCGGCAAC-结果倒置相差显微镜下观看：每克软骨组织经酶消化后取得±×106细胞，活力90%以上。刚接种的软骨细胞呈小圆球形，折光性强，悬浮于培育液中，细胞的大小大体一致。培育24～36h后原代细胞贴壁完成，呈扁平状，多角形，胞浆丰硕，胞核清楚，可见1～2个核仁(图1)。培育10～13d后，原代细胞90%融合，细胞形态不规那么，呈多边形、星形等，紧密排列成“铺路石”状外观，消化传代后，6h可见部份细胞已贴壁，增殖较快，5～6d后即可见细胞90%融合(图2，图3)。随着传代次数增加，细胞慢慢变成长梭形(图4)，4代后长梭形细胞慢慢增多，镜下细胞长而大，折光性差，部份细胞脱落，悬浮于培育液中。细胞活性检测结果四唑盐MTT比色法检测显示，第2代软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，1，2，3d处于生长暗藏期，4，5，6，7，8d细胞呈对数生长，约在9，10d达平台期，至第11d开始显现生长抑制，如图5所示。细胞免疫化学Ⅱ型胶原免疫组织化学观看显示P2代软骨细胞核周围可见棕褐色颗粒染色呈片状或团块状，为阳性结果(图6)；空白对照不染色(图。Ⅱ型胶原mRNA表达第1代及第2代Ⅱ型胶原含量相对较高，二者间不同无显著性意义。从第3代开始表达量明显下降，不同具有统计学意义，而内参β-actin 在各代中表达量恒定。结果见表 2及图8。表2不同代细胞Ⅱ型胶原mRNA表达量组别Ⅱ型胶原mRNA表达(x-±s)±*P3与P1和P2比较，P＜，**P4与P3比较，P＜3讨论软骨细胞分离培育1965年Smith第一将体外培育的软骨细胞用于软骨缺损修复，尔后，培育方式不断改良并慢慢成熟，随后 Manning等联合运用胰蛋白酶和胶原酶相结合的方式消化关节软骨，使软骨细胞从坚韧的软骨基质中分离，取得了数量多、纯度高的软骨细胞，接种于培育基中，软骨细胞能生长割裂，从而改变了软骨细胞不能割裂的传统观点。本研究借鉴其方式并加以改良，采纳联合酶序贯消化后将软骨细胞悬液和软骨块一起培育，细胞得率±× 106/g，存活率达到 90%。张英等5］单用%Ⅱ型胶原酶消化8～10h，胎儿关节软骨细胞取得率达±×107/g，活力为85%，张艳［2］采纳不同浓度Ⅱ型胶原酶（%，%）别离消化人残耳软骨及肋软骨标本16h，细胞取得率别离为±×106/g、±×106/g,还有年龄超过20岁的患者肋软骨骨化明显,没能消化取得软骨细胞。胶原酶具有细胞毒性，消化时刻太长,可造成细膜通透性或膜电位的改变，细胞水肿乃至破裂。本实验采纳%胰蛋白酶预消化30min,再用%胶原酶进一步消化。胰蛋白酶的要紧作用是使细胞间质的蛋白质水解,但浓度过大和时刻太长,也可损伤细胞。如此缩短了细胞浸泡于消化酶中的时刻，最大限度地爱惜软骨细胞的完整性和活性，取得较高活力的细胞。另外，本实验把未完全消化的软骨块与软骨细胞一起培育，软骨块可作为软骨细胞生长的支架，为软骨细胞生长提供了更好的生长背景。MTT实验结果显示P2代软骨细胞生长的暗藏期在1～3d左右，在这一期间细胞增殖缓慢，指数增加期在4～8d之间，此期是细胞一代中活力最好的时期，是进行各类实验最正确的和最要紧的时期，随后进入平台期，平台期的时刻为第 9～10d。第10d后，细胞仍有少量增殖，由于细胞的彼此接触开始产生接触抑制，整体水平骤减。这些数听说明，联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块一起体外培育，操作简单，切实可行。图1P0髂软骨细胞100×图2P1髂软骨细胞100×图3P2髂软骨细胞100×图4P4髂软骨细胞100×图5P2髂软骨细胞生长曲线图6Ⅱ型胶原免疫组化，阳性表达100×图7Ⅱ型胶原免疫组化，空白对照100×图8不同代细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达情形软骨细胞的生物学特性软骨由软骨细胞和胞外基质(包括胶原、蛋白多糖、透明质酸、糖蛋白等)组成。软骨细胞是软骨组织的要紧细胞成份，在软骨的生长及功能代谢中起着重要作用。糖胺多糖(glycosaminoglycans，GAG)及Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质中的重要成份，Ⅱ型胶原的合成与分泌可作为软骨细胞维持其分化表型的特定指标［六、 7］。但在体外单层培育进程中易发生去分化现象，尤其是成人软骨细胞，随着传代次数的增加，合成和分泌的Ⅱ型胶原慢慢减少。 本实验mRNA表达水平说明第一、2代细胞Ⅱ型胶原表达明显，而第 3代开始Ⅱ型胶原表达慢慢减弱，因此在第 2代以前软骨细胞能维持其特点性表型，具有良好功能。软骨细胞体外培育的意义体外培育技术，其本质是模拟机体内的生理环境，在无菌，适宜的温度、湿度和必然营养条件下，使活体的结组成份在体外环境中得以生存和生长，并维持其结构和功能。临床上软骨大面积缺损能够通过软骨组织工程方式取得修复，将自体软骨细胞体外扩增后再回植入体内，回植的细胞能与周围组织具有专门好的相容性，维持了良好的合成份泌功能，从而修补缺损［8］。软骨组织工程的来源部位有肋软骨、关节软骨及鼻中隔软骨，本实验从髂软骨成功培育出种子细胞，该部位取材方便，能够作为组织工程的候选部位。另外，软骨细胞体外培育体系的成功成立， 能够排除体内众多因素的干扰，为研究与软骨形成异样等相关疾病的病因及发病机理提供种子细胞。众多学者利用此技术开展退行性、发育性等相关脊柱疾病发病机理的研究工作， 已取得了丰硕的功效。AIS是一种复杂的脊柱三维畸形，在众多的发病因数中，生长发育异样是目前研究的热点之一。Ylikoski ［9］大体形态学测量发觉 AIS女孩矫正身高要显著高于健康女孩的平均身高。 Zhu等［10］从组织学研究说明 AIS前后柱软骨细胞增殖活跃不同，前柱高于后柱，并阻碍侧凸的进展。 Moreau等［11］证明AIS患者成骨细胞水平cAMP信号通路存在异样，而cAMP作为第2信使在细胞中普遍存在，该通路软骨细胞中是不是异样有待进一步研究。因此，从分子生物学及细胞水平探访AIS患儿体内软骨内成骨及信号传导情形，为深层次的探访AIS病因学研究提供了新的思路。作者采纳联合酶消化法分离、培育取得种子细胞，为后续研究打下基础。综上所述，采纳联合酶序贯消化法将软骨细胞悬液和软骨块一起体外分离培育软骨细胞，能够取得数量多、活性优的软骨细胞，为软骨组织工程及研究相关疾病发病机理提供种子细胞。在本研究的基础上，作者以为P2代细胞作为相关研究的种子细胞最为理想。【参考文献】［1］ Guerne PA,Blanco F,Kaelin A, et factorresponsivenessofhumanarticularchondrocytesinaginganddevelopment［J］.ArthritisRheum,1995,38:960-968.2］张艳，柴岗，崔磊，等.不同类型人软骨细胞体外生物学特性比较［J］.中华实验外科杂志,2003,20:497-498.3］IsogaiN,KusuharaH,IkadaY,etal.Comparisonofdifferent chondrocytes for use in tissue engineering ofcartilagemodelstructures ［J］.TissueEng,2006,12:691-703.4］靳小兵，罗卓荆，杨柳，等.人胚肋软骨静止