DB12T 1019-2020猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法

ICS65.020.30DB12天津市地方标准DBT1019—2020RTPCRassayfordetectionofporcinedeltacoronavirus天津市市场监督管理委员会发布前言GBT1.1-2009给出的规则编写。。草单位：天津市畜牧兽医研究所。RTPCR测方法本标准规定了猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，PDCoV)RT-PCR检测方法的原理、备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技术内容。用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PDCoV核酸的检测。缩略语。PDCoV：猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus)PCR：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementaryDNA)PK-15细胞：猪肾细胞(porcinekidneycell)DEPC：焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)PBS：磷酸缓冲液(phosphatebuffersolution)TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液(trisacetate-EDTAbuffer)理外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。依据PCR试验结果，判断样品中是否含有PDCoV。4主要仪器设备分析天平(精度0.01g)、超低温冰箱(-80℃)等。试剂与引物5.1试剂聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker、核酸染料、磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mol/L，pH7.2)、TAE电A试剂均为分析纯。5.2引物PDCoVM基因PCR扩增方法所用引物见表1：ATTCTGCTTTGGCTGCTC3'TCCTGTGGCGGATTTC3'对照样品的采集及处理采样工具mL21(±2)℃，15min高压灭菌，50℃~60℃烘干备用。采样方法PBS1.5mL离心管中。样品保存及运输样品处理nA7.3反转录反应(cDNA的合成)条件为：30℃10min，42℃1h，99℃5min。得到的cDNA溶液直接用于下面的PCR扩增或者-20℃冻ss72℃30s，30cycles；72℃7min。电泳及观察PCRLL缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一in结果判定1质控标准2结果判定_________________________________A(规范性附录)A.1PBS缓冲液A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠71.6g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠27.6g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000AmolLmLmolL14mL，称取氯化钠8.5g，子水溶解稀释至1000mL，4℃保存。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠A.2.2TAE电泳缓冲液(50×)羟基甲基氨基甲烷(Tris)molL铵四