分光光度计课件

分光光度法主要内容

光谱分析法

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分光光度计

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实验步骤和要求3[目的要求]掌握：分光光度法原理；可见分光光度计的波长校正。熟悉：血红蛋白及衍生物吸收光谱测定；光谱分析技术的分类及常用方法。罗怕特-威廉-本生光谱分析法的发明者

1811年3月31日出生在德国哥廷根，他的发现用氢氧化铁作为砷中毒的解毒药的办法。1859年本生和基尔霍夫研究加热的金属的放射光谱。完善了汽灯，发明了本生灯。此灯的温度可达230O°C，且没有颜色一、概述利用各种物质所具有的发射、吸收或散射的特性以确定物质的结构和化学成分的分析方法称为光谱分析法。英文为spectralanalysis或spectrumanalysis。各种结构的物质都具有自己的特征光谱，光谱分析法就是利用特征光谱研究物质结构或测定化学成分的方法。

可见、紫外分光光度法吸收光谱

原子吸收分光光度法红外分光光度法发射光谱荧光分析法火焰发射光谱法散射光谱比浊法分光广度法的优点：灵敏度高测定简便快速，仪器设备简单。不破坏样品(1)光的基本性质:电磁波的波粒二象性

c－真空中光速2.99792458×108m/s ~3.0×108m/sλ－波长，单位：m,cm,mm,m,nm,Å

1m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10mν－频率，单位：赫芝（周）Hz次/秒V=c/λ光的传播速度:c=λX

ν波动性

h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s

－频率

E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)

V=E/h光量子，具有能量。

E=hv光的微粒性将光（电磁波）按波长（或频率）顺序排列，即得电磁波谱。200nm400nm760nm1mm

紫外线可见光红外线不同波长的光具有不同能量，波长越长（频率越低），能量越小。可见光三、吸收光谱与分光光度法1、吸收光谱（Absorptionspectrum）

原子吸收光谱分子吸收光谱

当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)。完全吸收

完全透过吸收黄色光物质的颜色与光的关系对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性的吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的光透过程度相同，这种物质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，也就是溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色。例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色；2、光吸收的基本定律（Lamber-Beer定律）单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。入射光透射光bI0I1CIa被物质吸收的光tLambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其透射光强度随液层厚度的增加而成指数函数减少，即It=Io*10-k1b其吸光度与光通过的液层厚度成正比。式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。

（2）Beer定律：说明吸收与溶液浓度间的关系c1C2入射光透射光入射光透射光C1＞C2，I2＞I1

I0I1I0I2Beer定律：当一适当波长的单色光通过溶液时，若液层厚度一定，透射光的强度随着溶液浓度的增加而成指数函数减少，即It=Io*10-k2c其吸光度与溶液浓度成正比。

式中c为物质的量浓度(或质量浓度)，k2为与吸光物质种类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。Beer定律仅适用于单色光。透射光强度It与入射光强度Io之比称为

吸光度用T表示则T=It/Io=10-abc

T的负对数值定义为吸光度用A表示则A=-lgT=lgIo/It=abcA（absorbance）表示吸光率（或吸光度）T（transmittance）表示透光率（或透光度）分光光度法利用物质的吸收光谱进行分析吸收光谱（absorptionspectrum）所谓吸收光谱就是用各种不同波长光线测定物质溶液的吸光度，然后按其结果描出吸光度与波长关系的曲线。吸收光谱是物质的特征性曲线，一种物质在一定的PH、温度、浓度等条件下，具有的一定形状的吸收光谱曲线

主要内容

光谱分析法

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分光光度计

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实验步骤和要求30.208光源单色器比色杯检测器(光电元件)读数单元分光光度计紫外-可见分光光度计的基本结构示意图

光源：可见和紫外分光光度计装有两种光源灯泡：钨丝灯，产生可见光；氢弧（氘）灯，产生紫外线。由于玻璃吸收紫外线，所以氢弧灯的灯管多用石英制成，或在灯管上设有石英窗。

色散元件（棱镜或光栅）单色器：

光狭缝单色器的作用是将混合光分解（色散），并可根据需要使一定波长的单色光投射至比色槽。比色杯：

形状大多为矩形。比色杯的光径（溶液厚度）愈大，吸收的光能愈多，灵敏度愈高。光电元件：光电管或光电倍增管

作用：将光能转变成电能。光电管产生光电流的大小，与光强度和波长有关。光电管对弱光的灵敏度大，光照过强或长时间曝光灵敏度显著下降，即“疲劳”现象。温度对光电管的灵敏度有影响。

电子放大器读数单元

读数元件定量测定

1、利用标准曲线计算测定物含量

先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。

标准曲线(浓度-吸光度曲线）对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。0.20.80.40.6AC●●●●②对比法：将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度：

As=abCs；Ax=abCxCx=CsAx/As

由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度：主要内容

光谱分析法

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实验步骤和要求3

722型分光光度计722型分光光度计操作步骤1、开机，打开盖板，预温30min；2、将转换旋钮转至“T”，用“0”旋钮以“空白”调透光度至零；3、盖上盖板，光路自动打开，用“100”旋钮调透光度至100%，若不能调至100%，可调节灵敏度旋钮；4、将转换旋钮转至“A”，此时吸光度A应为零，若非零，调节“消光零”旋钮至零；5、拉动横杆，读取吸光度。实验一可见分光光度计波长校正原理：镨铷玻璃是一种含有稀有金属镨和铷的玻璃制品，在可见光波长范围内，具有特征性的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作为校对仪器波长正确性的一个依据。操作步骤：

用镨铷玻璃与空白光路作对照，每隔2nm，在529nm附近每隔1nm，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，测出波长从524nm～538nm的镨铷玻璃吸收吸光度，查找吸收峰的极值。实验二血红蛋白及衍生物吸收光谱测定原理：血红蛋白在不同条件下可以形成不同的衍生物，如血红蛋白溶液在空气中与氧气充分接触可形成氧合血红蛋白HbO2，与一氧化碳反应则会合成碳氧血红蛋白HbCO，高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白（MHb）。HbO2HbCO组成成分不同分子结构不同MHb

特有吸收光谱操作步骤：1.样品的制备5mlH2O+Hb(2滴)5mlH2O+Hb(2滴)+铁氰化钾（1滴）

（棕色)2.测定：470nm-650nm范围内，每隔20nm测吸光度一次，接近高峰时，每隔2nm测波长一次，绘制Hb和MHb吸收光谱曲线。注:每次调节波长，必须重新校正零点！吸收光谱曲线绘制以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，描出所有测量的点，用曲线连接在坐标轴上标出波长、吸光度以及单位标出最大吸收峰处的波长及吸光度在上方注明曲线的名称“血红蛋白及其衍生物吸收光谱曲线”在曲线旁边标注曲线对于的物质把姓名序号标注在空白处注意事项

1、比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随意挪用。2、比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。3、盛液时达到比色杯的3/4即可，不能太满，外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。4、测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。

5、测量完毕，比色皿用蒸馏水洗干净。思考题：722型分光光度计为什么每变换一次波长都需要重新调零？由于比色仪光电管对不同波长和频率的光的敏感度是不同的，所有每一次调