5.3血红蛋白的提取及分离

课题3

:

血红蛋白的提取和分离

PCR反应需提供的条件1:缓冲液中进行2:DNA模板3:分别与两条模板链相结合的两种引物4:四种脱氧核苷酸5：耐热的DNA聚合酶6：同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行

5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋引物一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶一小段RNA血红蛋白介绍：

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白是由574个氨基酸脱水缩合而成的含有四条肽链的蛋白质（两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素）。氧气结合在铁原子上，被血液运输。因含血红素血红蛋白呈红色。血红蛋白占红细胞干重97%、总重的35%。平均每克血红蛋白可结合1.34ml的氧气，是血浆溶氧量的70倍。一个哺乳动物血红蛋白分子可以结合最多四个氧分子。血红蛋白也参与其他气体的转运：它能携带机体的部分二氧化碳（大约10%）。回忆：蛋白质基本单位？合成场所？蛋白质的分子结构具有多样性的直接原因？根本原因？蛋白质的功能？思考：蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。主要功能实例组成细胞的结构成分细胞膜中的蛋白质，染色体中的蛋白质等运输功能细胞膜上的载体蛋白、运输氧气的血红蛋白等催化功能胃蛋白酶、纤维素酶等调节功能生长激素、胰岛素等激素免疫功能B淋巴细胞受到抗原刺激后产生的抗体一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）

2、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快（分子筛效应）用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快4、具体过程D相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B㈡缓冲溶液：2、作用：能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值1、组成：

由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成如:H2CO3/NaHCO3;CH3COONa/CH3COOH，NaH2PO4/Na2HPO4;KH2PO4/K2HPO4等3、缓冲溶液的配制:通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。㈢电泳：1、概念：

2、原理：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。从而实现样品中各种不同蛋白质分子的分离。3.分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（）通常用SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异附录资料：不需要的可以自行删除常见即发输血不良反应1.发热反应

2.过敏反应

3.溶血反应一输血不良反应的定义输血不良反应是指在输血过程中或输血后，受血者发生了原来疾病不能解释的、新的临床症状和体征。输血不良反应中最常见的是输血免疫反应。二输血不良反应的分类1、按发生的时间分为:

即发型输血反应迟发型输血反应2、按免疫学分为：免疫性输血反应非免疫性输血反应各种血液成分的输血不良反应及类型

1.不同品种发生不良反应率：白细胞6.49%；浓缩红细胞1.06%；洗涤红细胞0.47%；血小板0.4%2.不良反应率：发热反应52.1%（发生率2.9%

）；过敏反应42.6%；溶血反应4.5%四常见输血不良反应1.发热反应2.过敏反应3.溶血反应4.输血相关的急性肺损伤5.输血后紫癜6.血小板输注无效7.循环负荷过重8.肺微血管栓塞9.输血相关性移植物抗宿主病10.细菌污染性输血反应1.发热反应

发热反应：是指在输全血或血液成分期间或输血后1~2小时内，体温升高1℃以上，并以发热、寒颤为主要临床表现一类的输血反应为发热反应。（1）发生原因致热原:一般指引起发热反应的各种微量物质，包括细菌性热源、药物中的杂质，非蛋白质的有机或无机杂质、采血器材或输血器上的残留变性蛋白质等。免疫反应:大多数发热反应与多次输入HLA（人类白细胞抗原：HLA-I类分子：内源性抗原的递呈分子HLA-Ⅱ类分子：外源性抗原的递呈分子)

不相合的白细胞、血小板有关。其他反应的早期症状。1.发热反应1.发热反应（2）症状与体征 一般在输血开始15分钟至2小时，突然发热、畏寒、寒颤、出汗，体温可高达38~41℃。此外，其他症状尚有恶心、呕吐、皮肤潮红，但血压无改变。持续少则十几分钟，多则1~2小时，然后可以完全恢复正常。在全麻状态下，发热反应很少出现。1.发热反应（3）诊断输血开始至2小时以内体温升高1℃以上，并伴有发热症状。受血者有多次输血史或妊娠史，既往输血发热反应史，或献血者血清中有HLA、粒细胞和血小板抗体。应同轻症溶血性输血反应和细菌污染反应相鉴别。1.发热反应（4）预防血站：采、输血器具和制剂的制备过程中做到无致热原。护理：采血和输血应严格无菌操作。医生：反复发生输血反应患者，最好输少白细胞的红细胞和洗涤红细胞。对于已经开始出现发热的病人应及时停止输入。（或者减慢输入速度，退热及抗过敏处理，排除溶血等其他严重并发症，因为溶血的早期症状也可能只有发热。）2.过敏反应

过敏反应：包括单纯性荨麻疹、血管神经性水肿和更严重者出现呼吸障碍、休克等表现。是常见的输血反应之一，其发生率为3%，占输血总反应率的42.6%。2.过敏反应

（1）发生原因：2次以上接触致敏原，致使介质细胞脱颗粒。IgA、IgG同种异型抗体、其他免疫球蛋白多聚体等均可作为致敏原使机体致敏；受血者过敏体质；被动获得性抗体。2.过敏反应（2）症状与体征过敏性输血反应，一般发生在输血数分钟内或输血后立即发生。轻度过敏反应：全身皮肤瘙痒、皮肤红斑、荨麻疹、血管神经性水肿（多见于面部）和关节痛、血液噬酸性粒细胞增多。重度过敏反应：支气管痉挛、喉头水肿、呼吸困难、哮喘、紫绀，更严重的可出现过敏性休克。部分患者可伴有发热、寒战、恶心、呕吐、腹泻、腹痛等。2.过敏反应（3）预防有过敏史者，在输血前半小时，口服抗组胺类药物，如苯海拉明、非那根（异丙嗪）或类固醇类药物。不输用有过敏史献血者的血浆（致敏原一般存在于血浆）。对高危（有抗-IgA或限定特异性抗-IgA抗体的)患者输血时，应选用洗涤红细胞，或缺乏IgA献血者的血液。2.过敏反应

（4）发生过敏反应后处理：及时停止输血；抗过敏处理：静脉注射地塞米松、苯海拉明、异丙嗪等药物；视情况吸氧、心电监护、气管插管、肾上腺素抗休克、扩容等。3.溶血性输血反应

患者接受不相容红细胞或对其自身红细胞有同种抗体的献血者血浆，使献血者红细胞或自身红细胞在体内发生异常破坏，而引起的不良反应，称为溶血性输血反应。溶血反应的严重度取决于：输入不相容红细胞量，血浆中抗体浓度和激活补体的能力、补体浓度、抗体特性、抗原特性、单核巨噬细胞系统的功能和输血速度等。溶血反应按其发病缓急分为：（1）急性溶血性输血反应于输血后24小时内发生，多于输血后立即发生。（2）迟发性溶血性输血反应主要是对先前存在致敏抗原，产生回忆应答的结果。多半在输血后3~7天发生溶血反应。

3.溶血性输血反应

3.急性溶血性输血反应1）发生原因ABO血型不合（最常见、最严重）、A2亚型不合输注不相溶性血浆献血者之间血型不合RH血型不合其他稀有血型不合一般血清学方法未能发现的血型抗体（3.1）急性溶血性输血反应3）症状与体征寒颤、发热、心悸、头涨、面红、腰背痛、恶心、呕吐、腹痛、呼吸困难、烦躁等症状。血红蛋白尿，黄疸等休克、DIC、急性肾功能衰竭。在处于全麻状态下，出现不能解释的手术区严重出血及低血压可为溶血反应的唯一表现。个别患者因免疫功能低下，血中抗体效价低，误输入少量异型血而不出现典型溶血反应症状。有时症