东南大学生化王大勇

Chapter9:Kineticsofenzyme-catalyzedreactionsenzymekinetics:Todeterminetherateofanenzyme-catalyzedreactionandhowitchangesinresponsetochangesinexperimentalparametersisknownas~.Factors：enzymeconcentration、substrateconcentration、pH、temperature、activator、inhibitor.当前1页，总共69页。酶促反应动力学（kineticsofenzyme—catalyzedreactions）是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。当前2页，总共69页。意义：1）研究酶的结构与功能的关系及作用机制。2）发挥酶催化反应的高效率,寻找最有利的反应条件。3）了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制。当前3页，总共69页。一、化学动力学基础

（一）反应速率及其测定

（二）反应分子数和反应级数

（三）各级反应的特征当前4页，总共69页。（一）反应速率及其测定反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。随着反应的进行，反应物逐渐消耗，分子碰撞的机会也逐渐渐小，因此反应速率也随着减慢。当前5页，总共69页。（二）反应分子数和反应级数1.反应分子数2.反应级数反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。有一个反应的分子参加的反应为单分子反应。有两个反应的分子参加的反应为双分子反应。3个分子同时反应的几率很小。总反应速率与浓度的关系以单分子反应的速率方程式表示，为一级反应。以双分子反应的速率方程式表示，为二级反应。当前6页，总共69页。（三）各级反应的特征1.一级反应反应速率与反应物浓度呈正比。2.二级反应反应速率与反应物浓度的二次方（两种底物浓度的乘积）成正比。3.零级反应反应速率与反应物浓度无关而受其他因素的影响而改变的化学反应。当前7页，总共69页。二、底物浓度对酶反应速率的影响

（一）中间络合物学说

（二）酶促反应的动力学方程式

（三）多底物的酶促反应动力学当前8页，总共69页。（一）中间络合物学说

在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间络合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+S====E-SP+E

许多实验事实证明了E－S络合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。当前9页，总共69页。酶催化的中间产物理论E+SP+EES能量水平反应过程GE1E2酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。当前10页，总共69页。1.ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。2.许多酶和底物的光谱性在形成ES复合物后发生变化。3.酶的物理性质，经常在形成ES复合物后发生变化。4.超离心沉降过程中，可观察到酶和底物的共沉降。当前11页，总共69页。（二）酶促反应的动力学方程式

1.米氏方程及推导

2.动力学参数的意义

3.利用作图法测定Km和Vmax值当前12页，总共69页。1.米氏方程及推导

底物浓度对酶促反应速度的影响

米氏方程

米氏方程的推导当前13页，总共69页。底物浓度对酶促反应速度的影响在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。当前14页，总共69页。当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax当前15页，总共69页。随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当前16页，总共69页。当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax当前17页，总共69页。米氏方程Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度当前18页，总共69页。米氏方程的推导基本前提中间复合物学说:E+SES→E+P

当前19页，总共69页。当前20页，总共69页。2.动力学参数的意义

(1)米氏常数的意义

(2)Vmax和K3（Kcat）的意义

(3)Kcat/Km的意义当前21页，总共69页。(1)米氏常数的意义①Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。②如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。③Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。当前22页，总共69页。④Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即k2>>k3，Km=Ks。在Km=Ks时，Km可表示酶和底物的亲和力。⑤催化可逆反应的酶正逆方向反应的Km是不相同的，测定细胞内Km和正逆方向反应的底物浓度，可大致推测正逆反应的效率，判断酶在细胞内的催化的主要方向。当前23页，总共69页。(2)Vmax和K3（Kcat）的意义Vmax：在一定酶浓度下，酶对于底物的Vmax是一个常数。K3：表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物分子数，即催化常数。当前24页，总共69页。过氧化氢酶溶菌酶当前25页，总共69页。(3)Kcat/Km的意义在生物体内，[S]/Km比值通常介于0.01与1.0之间。Kcat/Km是E与[S]反应形成产物的表观二级速率常数。当前26页，总共69页。3.利用作图法测定Km和Vmax值1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax当前27页，总共69页。双倒数作图法-1/Km1/Vmax斜率=Km/Vmax当前28页，总共69页。当前29页，总共69页。当前30页，总共69页。（三）多底物的酶促反应动力学双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类:A+B P+Q

双底物双产物的反应

序列反应（sequentialreactions）乒乓反应（pingpongreactions）有序反应

（orderdreactions）随机反应（randomreactions）当前31页，总共69页。有序反应及动力学方程

E+A+B—ABE—PEQ—E+P+QA为领先底物当前32页，总共69页。动力学方程当前33页，总共69页。当前34页，总共69页。随机反应动力学方程特点是：底物A和B随机和酶结合，产物P和Q随机和酶脱离当前35页，总共69页。乒乓反应

（双置换反应）动力学方程双置换反应的特点是：酶同A的反应产物（P）是酶同第二个底物结合之前释放出来，相应的酶转变E’。当前36页，总共69页。当前37页，总共69页。乒乓反应动力学方程当前38页，总共69页。乒乓反应动力学曲线图当前39页，总共69页。三、酶的抑制作用

（一）抑制程度的表示方法

（二）抑制作用类型

（三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别

（四）可逆抑制作用动力学

（五）一些重要的抑制剂能够和酶的必需基团结合，改变必需基团的结构和性质，酶未发生变性，从而引起酶活性的下降，甚至使酶的活性完全丧失的现象称酶的抑制作用。能引起抑制作用的物质称为抑制剂。当前40页，总共69页。（一）抑制程度的表示方法1.相对活力数α＝vi/v02.相对活力百分数（残余百分活力数）α%＝vi/v0×%3.抑制分数:指被抑制失去活力的百分数i=1-α%=1-(vi/v0)4.抑制百分数i%=1-α%=1-(vi/v0)×%当前41页，总共69页。（二）抑制作用类型抑制作用可逆抑制不可逆抑制

竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制当前42页，总共69页。不可逆抑制抑制剂与酶的必需基团以共价形式结合，引起酶的活行丧失。不能用透析、超滤等物理的方法除去抑制剂使酶复活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。当前43页，总共69页。可逆抑制

抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。

竟争性抑制

非竟争性抑制

反竞争性抑制作用当前44页，总共69页。竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。当前45页，总共69页。当前46页，总共69页。*举例

丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸当前47页，总共69页。非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。当前48页，总共69页。当前49页，总共69页。反竞争性抑制作用酶与底物结合后抑制剂才能和酶结合，反竞争性抑制作用常见于多底物反应。例：肼类化合物抑制胃蛋白酶。当前50页，总共69页。（三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别1.物理方法用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2.动力学方法在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓度作图。当前51页，总共69页。当前52页，总共69页。（四）可逆抑制作用动力学

竞争性抑制作用

非竞争性抑制作用

反竞争性抑制作用

不同类型可逆抑制剂米氏方程和常数当前53页，总共69页。

+IEIESP+EE+S竞争性抑制作用

实例：磺胺药物的药用机理H2N--SO2NH2对氨基苯磺酰胺H2N--COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤叶酸当前54页，总共69页。竞争性抑制曲线当前55页，总共69页。非竞争性抑制作用

+IEI+SESIESP+EE+S+I实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）当前56页，总共69页。非竞争性抑制曲线当前57页，总共69页。反竞争性抑制作用ESIESP+EE+S+I当前58页，总共69页。反竞争性抑制曲线

当前59页，总共69页。不同类型可逆抑制剂米氏方程和常数当前60页，总共69页。（五）一些重要的抑制剂1.不可逆抑制剂

（1）非专一性不可逆抑制剂

（2）专一性不可逆抑制剂

2.可逆抑制剂当前61页，总共69页。（1）非专一性不可逆抑制剂有机磷化合物:有机汞、有机砷化合物:重金属盐:烷化试剂:氰化物、硫化物和CO:青霉素:当前62页，总共69页。（2）专一性不可逆抑制剂

Ks型不可逆抑制剂（亲和标记试剂）抑制剂具有与底物相似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能和酶分子中的必需基团结合，从而抑制酶的活性。专一性并不是很高。

Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）

Kcat型抑制剂不但具有与底物相似的结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的反应。专一性特别高。当前63页，总共69页。2.可逆抑制剂可逆性抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制剂。1.抗代谢物2.过渡态类似物5’氟尿嘧啶类似于尿嘧啶，影响核酸合成。对氨基苯磺酰胺类似于对氨基苯甲酸，影响叶酸合成。过渡态底物是指底物和酶结合成中间产物后被活化的过渡形式，和酶结合紧密，过渡态类似物和酶结合能