胚胎移植技术及其研究进展概述

胚胎移植技术及其研究进展概述摘要：本文针对近年来的哺乳动物胚胎移植技术的研究热点，分别从胚胎移植的技术方法、胚胎移植技术的应用、胚胎移植技术的发展现状等方面进行了分析，并且对胚胎移植技术在转基因中的应用进行了总结。对胚胎移植技术的应用前景、存在问题和危害进行了简略的概括。关键词：供体；受体；胚胎移植技术；繁殖；前景ResearchandoverviewofEmbryotransfertechnologyAbstract:Inrecentyears,themammalianembryotransfertechnologyisfocusingonthetechnicalmethods,thewayweuseit,itsdevelopmentstatusandotheraspects.Andembryotransfertechnologyfortheapplicationoftransgenicaresummarized.Keywords:Donor;receptor;embryotransfertechnology;reproduction;prospects胚胎移植是将良种雌性动物配种后的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育成为新个体，所以也称作借腹怀胎。其中，提供胚胎的个体为“供体”（doner），接受胚胎的个体为“受体”(recipient)。胚胎移植实际上是产生胚胎的供体和孕育胚胎的受体分工合作共同繁育后代的过程。引言胚胎移植被认为是继家畜人工授精技术之后家畜繁殖领域的第二次革命。人工授精技术极大地提高了优秀种公畜的利用率，胚胎移植技术则极大地增加了优秀母畜的后代数，挖掘了母畜的遗传和繁殖潜力。在畜牧业生产与科研中，胚胎移植技术主要用于以下几个方面：（１）增加进口纯种畜和优秀个体的后代数。用于纯繁扩群，增加种畜的数量。（２）缩短家畜的改良周期，加速品种改良。纯种牛的胚胎移植给黄牛，可将15－20年的改良周期变为一年，大幅度地提高了家畜的遗传品质和生产性能。（３）用于单胎动物的育种，可缩短选择种牛的年限。如牛的MOET育种方案比后裔测定育种方法遗传进展快。（４）移植产双胎，提高生产效率。对肉用家畜尤其有价值。同时移植双胚或双半胚或在配种后第7天前后移植一枚胚胎，可获得30%以上的双犊率。（５）代替种畜的引进。（６）保存品种资源。保存于具有优良遗传特性的家畜胚胎库、基因库，保护濒临灭绝的家畜和动物品种。（７）用于一些疾病的诊断和治疗。（８）发展家畜生物技术的研究手段。这项技术是胚胎分割、嵌合、核移植、体外受精和转基因动物等家畜生物技术不可缺少的技术革新手段，也可用于生物学和医学的研究。特别值得一提的是，通过胚胎移植产下的后代可从本地母牛获得免疫，疾病抵抗力增强，胚胎传染疾病的危险性减小。目前胚胎移植技术被越来越多地用于牛的引种和牛群的品种改良。2.胚胎移植的程序包括供体和受体动物的准备﹑超数排卵、供体母牛的配种、胚胎的收集、胚胎的检查、胚胎的保存和胚胎的移植等技术程序。现将其主要的几个技术环节介绍如下：2.1供体和受体的选择2.1.1供体的选择供体的选择是胚胎移植技术最为重要的环节.胚胎移植计划首先是对供体资源进行调查，依据调查资料，运用各种科学方法做出综合评定，选出符合要求的个体作供体。要求供体生产、繁殖、抗病性能好和使用年限长，具有较高的遗传力，且遗传性稳定、谱系清楚，有重要的育种价值。经过血统、生产性能和体型审查，选择经济性能优越、生殖机能正常、对超数排卵有良好反应的健康母体。以年龄在3-10周岁以内、经产2-5胎、产后60天以上的母牛作为供体为宜。预作为供体的母牛，最好有一次完整的生产记录(产犊、产奶)，以衡量其种用价值。以上标准是一般性原则,可根据实际情况灵活运用。2.1.2受体的选择虽不要求具有优良的遗传品质，但应该具有良好的繁殖性能和健康体态，无疾患,体型中等以上。供体与受体的发情时间应该相同，前后差异不超过1d。必要时对供、受体进行同期发情处理。2.1.3同期发情发情鉴定不仅费时费工，还易发生人为误差，而且大多数情况下.需要一定数量与供体母牛同步发情或与胚龄同步的受体母牛，只靠选择自然发情同步的供体与受体可行，但难以满足规模化生产和缩短时间的要求，因此，多采用激素处理调节法。如用15一甲基PGF2a、前列腺素类似物、新型畜用前列腺素一抓前列烯醇(系英国1.C.1,公司首创新型畜用前列腺素类似物)等外源性激素对牛只进行处理，可调整一群母牛的发情，达到使其发情和排卵的时间同期化的目的。例如:用氛前列烯醇(0.2mg/2m1/支)进行同期发情处理一般是二次注射法(肌注)，经产牛0.3-0.4mg/次，育成牛0.2-0.3mg/次。可在任意一天进行第一次注射，再于随后的第11天作第二次注射。奶牛胚胎移植及相关技术应用研究之后的24-96h观察发情。供体牛发情在8-12h之内作第一次输精，20-24h之内第二次输精。每次输精有效精子数不少于30X106精子数，精子活力不低于0.3。受体牛则在发情日后的第6-8天进行胚胎移植。2.2超数排卵在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中有较多的卵胞发育和排卵，这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛作超数排卵处理，以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右，太少会降低胚胎移植的意义，同时胚胎的收集也有困难，超排过多会降低卵子的受精率和收集率。也就是说外源生殖激素作用下对供体母畜生殖系统所产生的一系列复杂生理过程，它将打破卵巢上只有一个卵泡成熟排卵的定势，解除单胎动物独卵泡(优势卵泡)发育对同一波其它卵泡发育的抑制作用，促使同波的卵泡群中大部分卵泡能够发育成熟、排卵、受精。超数排卵是动物胚胎移植产业化中的关键技术，但供体动物超排过程中的变异性限制了胚胎移植的产业化推广进程(Hasler等，1992)，动物超数排卵的目的是最大限度地获得受精卵和可用胚胎(Foote等.，1986)。然而，在实际生产中牛的超排反应和胚胎质量差异性很大.卵巢反应的差异性受许多因素的影响，如促性腺激素的种类(Elsden等，1978)、批号(Murphy等，1984)、处理的时间(Lindsell等.，1986)、剂量(Pawlyshyn等，1986)、牛的年龄(Hasler等，1981)、季节(Massey等,1984)、不同品种(Saumande等,1978)、超排处理时卵巢的生理状态(Moor等,1984)、营养状况(Hendricks等,1986).繁殖史(Hasler等，1983)和重复超排次数(Donaldson等,1983)等。在自然状态下，动物卵巢上约有99%以上的有腔卵泡发生闭锁而退化，只有不到1%的有腔卵泡能够发育成熟而排卵。超数排卵的过程就是应用超过体内正常水平的外源性促卵泡激素，使将要闭锁的有腔卵泡发育成熟而排卵。实验证明，在动物有腔卵泡闭锁之前，注射外源的FSH或PMSG激素，能使大量卵泡不闭锁而发育成熟;在排卵之前注射LH或hCG补充内源性LH的不足，可以保证大量成熟卵母细胞同时排卵，于是便形成了超数排卵。注射FSH并不能增加卵巢一个发情周期产生的卵子数最，但可以挽救正在成熟或萎缩的卵子，使其成熟、排卵。超声波扫描及其它研究的结果显示，大多数哺乳动物的卵泡发育是以“卵泡波”(follicularwave)的形式进行的，其实质就是指动物每个发情周期都会有一批或几批卵泡从原始卵泡发育到成熟卵泡的波浪状的一系列连续发育过程。哺乳动物在胚胎发育时期，由内胚层迁移至生殖io的原始生殖细胞(PGCs)经过多次有丝分裂增殖形成大量初级卵母细胞，被卵泡细胞包围后就构成原始萝p泡库(poolofprimordialfollicles)。原始卵泡库存在于哺乳动物生殖机能衰退前的很长一段时间里。在多数动物的每个发情周期中，原始卵泡库中均会有部分初级卵母细胞恢复减数分裂，卵泡开始生长，成为成熟卵母细胞的来源。图1胚胎移植程序示意图[23]超排处理一般方法为在预计发情到来之前4天，即发情周期的第16天注射促卵泡素或孕马血清促性腺激素，在出现发情的当天注射绒毛膜激素。目前各国对供体动物作超数排卵处理方法是供体母畜发情周期的中期肌注孕马血激素以诱导母畜有多数卵泡发育，两天后肌肉注射PGF2a。或其类似物以消除黄体，约2-3天后发情。各国超排处理方法见下(表2)表2各国超排处理一览表[12]超数排卵的效果受动物的遗传特性﹑体况﹑营养﹑年龄﹑发育周期的阶段﹑产后时期的长短﹑卵巢功能﹑季节以及激素制品的质量和用量等诸多因素的影响。为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2-3次，每次间隔8-12小时。所以不同的品种，特别是不同个体反应的差异较大，效果很不稳定，迄今仍是胚胎移植中有待研究改进的一个重要问题。2.3供体母畜的配种选择适当的时间，使用优良雄性动物的精液对供体动物进行输精。为了得到较多的发育正常的胚胎，使用密度大、活率高的精液输精，并且将输精次数增加到2-3次，间隔8-10h。2.4胚胎的收集最早用手术法，即剖腹进行子宫冲卵，那样对供体牛有一定的伤害，且恢复期较长，现在基本不采用了。目前普遍采用两通路或三通路冲卵管通过直肠把握进行，即高冲卵的非手术法。所需主要器材和药品有:冲卵管(经产牛用20#,育成牛用18#),子宫颈扩张棒.三通管，硅胶管，100ml,20ml注射器，集卵童筒或漏斗，毛剪，移植枪等;酒精，碘酒，新洁尔灭，生理盐水，2%利多卡因，青、链排素以及杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)，可自配或购GIBCO公司(美国)等的PBS粉剂直接用超纯水配制〕，小牛血清或牛血清白蛋白等，授精后第7或第8天用全封闭自动冲卵装置(如:FHK,日本，富士平工业公司)或简易的冲卵管进行非手术采卵。其操作要点主要包括:器械的消毒、冲卵液的准备，供体牛的保定，用2%利多卡因5-10ml/头实行尾椎硬膜外腔麻醉，冲卵管的插入和充气(约8-15m1)，冲卵液的灌入(20-50m1/次，每个子宫。胚胎收集的时间：一般在配种后3~8d，发育至4~8细胞期后；牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植。2.5胚胎的评定（如图2）移植的胚胎必须经过鉴定，证明是发育正常者。在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素（物理的、化学的、微生物的）影响。开展胚胎移植必须有充足的胚胎来源，具备优良品种基因的胚胎必须有保证。将回收液室温下(18-220C)静置15-20分钟后轻轻抽去上清液，在显微镜下对底部的沉积液逐一检查，查寻到胚胎后将其检出用配制好的保存液进行洗涤，再仔细观察，鉴定胚胎，根据胚胎形态及发育阶段将胚胎分为A(优秀)、B(良好〕、C(一般)级{按需要挑选出优质胚胎进行鲜胚移植或冷冻备用.也可将回收的冲卵液经孔径为0.75微米的胚胎过滤器滤过后，将少量残液置于20-40倍实体显微镜下检出胚胎，在NiKon倒置镜下按形态学分类法评定胚胎品质。其实，胚胎的鉴定方法很多，如:形态学鉴定、台盼蓝染色鉴别、培养鉴别、荧光基质代谢、死亡细胞的荧光测定以及代谢物质检测等，但最简便实用的还是形态学鉴定。2.6胚胎的保存和培养胚胎冷冻还另外需要:胚胎冷冻仪1台，0.25ml细管若干，细管塞若千，0.22u。针头式细菌滤器若干，035二培养皿4-5个以及装管器胚胎置于特制的保存液(PBS液加血清)中可在室温下短时间保存。但应考虑到保存时间和胚胎发育，老化等问题。胚胎的冷冻保存方法有慢速冷冻、快速冷冻、一步冷冻法和玻璃化法。其冷冻保护剂用甘油、乙二醇或二甲基亚矾(DMSO)，有的认为甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷冻。但有的采用DMSO效果较好。在生产条件下，现主要用于牛冷冻胚胎的是三步平衡和一步细管法:(1)10%甘油作冷冻保护剂将胚胎用保存液(M-PBS+20%FCS或0.4%牛血清白蛋白)洗10次后移入的冷冻液(10%甘油+保存液)中，再装入0.25ml塑料细管15-20min，随后置于程控冷冻仪的洒精浴槽内(如:ET一1型，FHK，富士平工业公司)(-4.9℃)平衡5min后在-3一-7℃时植冰(seeding)(7-10sec)，继续平衡5min,然后以0.3-0.6℃/min的速率降温至一30℃，平衡5min，取出胚胎细管，直接投入液氮中保存。解冻时，从罐中取出细管空气浴(18-25℃)。后浸入32℃水浴中l0sec(见冰晶消失为止)，然后将细管擦干，剪去细管塞，推出胚胎到解冻液(1M蔗糖+保存液)中4min，用保存液洗涤5-6次后，镜检，装管，把细管装入移植枪，移植给受体(胚胎解冻后30-45min内移入)。(2)用1.5mol/L乙二醇作冷冻保护剂将胚胎用保存液洗10次后一步移入的冷冻液(1.5mol/L乙二醇十保存液)中，再装入0.25ml塑料细管15-20min，随后置于程控冷冻仪(-6.5℃)平衡2min后在-3--7℃时植冰(seeding)(7-10sec)，继续平衡5min，然后以一0.6℃/min的速率降温至一35℃，平衡5min,取出胚胎细管，直接投入液氮中保存。解冻时，从罐中取出细管在空气中停留5-10sec后，浸入35℃水浴中10sec(见冰晶消失为止)，然后将细管擦干，用70%酒精棉球擦拭细管，晾干，剪去细管塞，把细管装入移植枪，移植给受体(胚胎解冻后5-8min内移入)。如果胚胎能在体外较长期的保存，并使它保持于取卵时状态，对胚胎移植的实际应用有很大的意义。这样就可以免去移植时要求的同期发情处理。可以不受时间、地点和选定受体母牛的限制，随时随地可以进行胚胎移植。胚胎保存的研究近年来发展很快，并已取得了一定的进展。胚胎冷冻前必须使其脱水，进行冷冻保护剂二甲基亚矾（DM-SO）的渗透处理。在室温下（20℃），预先配制含有DMSO浓度为0.25mol、0.5mol、1.0mol、1.5mol的加0.4%牛血清白蛋白的PBS溶液（磷酸缓冲液）。将胚胎依次浸入上述不同DMSO浓度的溶液中进行渗透处理，在每个浓度溶液中分别停留5-10min。最后用吸管将含胚胎的0.3ml的长颈安瓶中，并将口封好。以上操作均在解剖镜下进行，然后将安瓿置于14℃的水浴中。胚胎的解冻比冷冻速度快，-196℃--50℃（干冰酒精溶液中），-50℃-14℃每分钟升温4℃。解冻后，通常在室温下将安瓿打开，脱去冷冻保护剂DMSO。方法是将胚胎依次移入含DMSO浓度为1.25mol、1.0mol、0.75mol、0.5mol的磷酸缓冲液中，在每种浓度溶液中各停留5-10min，0.5mol溶液中可停留30min，最后移入不含DMSO的磷酸缓冲溶液中停留10min。再用磷酸缓冲液冲洗二次，取出后检查即可用于移植，也可以培养1小时（在37℃培养液中），将其中死的胚胎去掉，效果更好。胚胎冷冻以液氮为冷源。在可控制温度的液氮冷冻箱内进行。冷冻速率以英国为例：14℃至-7℃每分钟下降1℃，于-7℃时用在液氮中浸过的金属镊子夹一下有胚胎的安瓿，使之诱导结晶，胚胎迅速被玻璃化冻结，而不致产生有害的冰结晶。-7℃--36℃每次分钟下降0.3，-36℃--60℃每分钟下降0.1℃到-60℃时直接投入液氮中保存。从以上情况看，冷冻保存胚胎虽然冻后成活率和受胎率还很低，还需要在培养液、防冻保护剂、降温和升温速率等问题进行深入的研究。但是这确是胚胎保存技术的重大突破。2.7胚胎分割在立体显微镜下用一根固定在显微操作仪上的微玻璃针或刀片(也可徒手操作)对未作或已作软化透明带处理的胚胎进行由上向下的切割，将胚胎连同胚胎透明带分割成均等的两半。也可用固定吸管固定住胚胎，用微玻璃针先将透明带切个小口，再将微吸管自切口处伸入，吸住半数卵裂球，慢慢取出，这样是获得二分胚，若要继续再分割，就可得到四或八分胚。胚胎分割技术主要用途为:增加胚胎源提高胚胎的总妊娠率;生产同卵双生后代;提供有效的遗传育种试验材料;便于胚胎性别鉴定;增加和保存珍贵及濒危动物种等。目前该技术已进入应用阶段，切割后的鲜胚半胚移植成功率接近50%。2.8胚胎性别鉴定及控制几十年来，人们一直在寻找和分离决定性别的基因，认为在Y染色体上可能存在着指导辜丸分化的基因TDF(翠丸决定因子)。随着研究的深入，人们逐渐有了Y染色体、H-Y抗原、ZFY(锌指蛋白)、SRY(Y染色体性别决定区)的概念。因而，胚胎性别鉴定的方法也是针对这些因素的区分来进行的。目前已研发了许多种。主要有如下几种:2.8.1细胞生物学方法(染色体核形分析)主要是利用X,Y染色体在形态上的差异，通过判定胚胎细胞性染色体是X还是Y来鉴定胚胎的性别。该方法缺点或存在的困难是分析性染色体需要用分裂中期的细胞，而从桑甚期和囊胚期的胚胎里取出较多的分裂球刁‘能获得处于分裂中期的细胞，这要降低胚胎性别鉴定后移植妊娠率。2.8.2免疫学方法在8细胞期至早期胚泡期，哺乳动物的雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子，即H-Y抗原，利用H-Y抗原和抗体免疫反应的原理可以进行胚胎的性别鉴定。2.8.2.1胚胎的细胞毒性分析在补体(如豚鼠血清)存在的情况下，H-Y抗体可以与HY+胚胎(雄性胚胎)结合，并使其中的一个或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈现不规则的体积和形状，阻滞胚胎发育，受影响的胚胎即为雄性胚胎，将经培养后发育正常的雌性胚胎进行移植就可使母畜只生雌性后代。但这种方法是以破坏雄性胚胎为代价，而且其准确率不高，经这种方法鉴定的H-Y+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有85%为雌性，这种方法很少被使用。2.8.2.2间接免疫荧光分析法以H-Y抗体为一抗，用FTTC标记的Y球蛋白(如山羊抗鼠Y球蛋白)作为二抗，将上述两种抗体依次与胚胎共同培养，雄性胚胎上的H-Y抗原先与一抗结合，一抗再与二抗结合，然后通过洗涤将未结合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC标记，故在荧光显微镜下显荧光，雄性胚胎显荧光，不显荧光者为雌性胚胎。这是一种非损害性胚胎性别鉴定法，鉴定过的胚胎都可以存活。但准确率不高，牛83%.绵羊为83%,猪为81%.奶11:胚胎移植及相关技术应用研究2.8.2.3囊胚形成抑制法利用H-Y抗体能够可逆性抑制囊胚形成的原理，将H-Y抗血清与桑堪胚共同培养一段时间后雄性胚胎由于具有H-Y抗原被H-Y抗体所抑制，不能形成囊胚，而无H-Y抗原的雌性胚胎则不受影响继续发育成囊胚，因此可以将雌、雄胚胎分开。然后可洗去H-Y抗体，雄性胚胎继续发育。这种方法鉴定的胚胎存活率与正常无异，其正确率为80%左右。但只能检测桑根期前的胚胎。如果胚胎己发育至囊胚，则无法鉴定.2.8.2.4测定卵裂球X一染色休连锁基因剂且鉴别胚胎性别从胚胎中取出一个卵裂球，采用双重微量测定法，测定其与X一连锁的次黄AS吟磷酸核糖基转移酶(HPRT)和与常染色体连锁的腺嗓吟磷酸核搪基转移酶(APRT)的活性。由于在8一细胞阶段，雌性胚胎中的两条X染色体均有活性，因此可根据HPRT活性在基因剂量上的两倍差异，得到HPRT与APRT比率的双态分布图，因而鉴别出雄性和雌性胚胎，该方法比较繁琐，所需时间长。2.8.3分子生物学方法2.8.3.1y一染色体特异性DNA探针利用Y一染色体特异的DNA探针与Y一染色体的DNA进行特异性结合，以鉴定胚胎性别的一种方法。早在1988年，Eilis等就将牛的Y一染色体DNA重复序列探针用于牛胚胎的性别鉴定。其检测的方法有两种:一种是原位杂交;另一种是用探针与DNA提取物相结合。这种方法的准确率超过95%。但是这些特定序列通常具有种间特异性，所以对每种动物都必需研制不同的探针.另外，原位杂交有时还需使用放射性物质.这种方法没有被推广。2.8.3.2聚合酶链式反应(PCR)Hert等(1990)首先成功建立了家畜胚胎性别鉴定的PCR法。PCR法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术.即通过合成SRY基因或其他Y-染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行PCR扩增反应，能扩增出目标片段的胚胎即为雄性胚胎，否则即为雌性胚胎。由于PCR极为灵敏，所以只要从胚胎中取出几个细胞就可以进行性别鉴定，这对性别鉴定后胚胎移植的妊娠率没有影响。Utsumi等1992年研究结果证明，用PCR技术检测Y染色体上的SRY片段准确率达到100%，与性染色体检查法对照证明结果是一致的.龚荣慈等实验表明:只要8Pg的DNA即可检出ZFY。以ZFX序列而判定胚奶牛胚胎移植及相关技术应用研究胎的雌雄。在国内，曾溢滔等(1991)就通过对牛SRY基因的直接测序，设计引物用PCR扩增SRY基因来检测奶牛胚胎的性别，杨建明等(1995)、欧阳红尘(1995)等则通过扩增牛Y染色体特异DNA序列来鉴定牛早期胚胎性别，而龚荣慈等设计了特异于牛ZFY基因的引物对奶牛基因组DAN进行NestPCR来进行性别鉴定。黄淑帧等通过扩增SRY基因对转基因试管牛和试管羊胚胎进行了性别鉴定，得到的转基因牛和转基因羊的性别和鉴定结果完全一致。用PCR鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为:①胚胎的获取:冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别;②引物的设计:根据Y染色体上的性别决定基因或特异性片段设计引物，同时设计一对公母共有基因引物作为内对照，避免假阳性的发生;③用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞热处理后进行PCR扩增;④电泳检测。能同时扩增出Y-染色体上相应片段和公母共有基因片段的胚胎即为雄性胚胎，而只能扩增出共有基因片段的胚胎即为雌性胚胎。据中国农科院畜牧所罗应荣等报道，应用PCR试剂盒鉴定性别准确率为97.796[24]PCR鉴定胚胎性别的研究成功，使胚胎的性别鉴定进入了一个崭新的发展阶段，但是只有进一步研究简易快速的胚胎切割取样技术取样胚胎的冷冻保存技术，能达到推广应用阶段、胚胎性别鉴定的PCR试剂盒以及取样胚胎保存技术，才能达到推广应用阶段。2.9胚胎移植2.9.1手术法移植（如图3）是按外科剖腹术的要求进行术前准备。手术部位于右胁部或腹下乳房至脐部之间的白线切开。伸进食指找到输卵管和子宫角，引出在切口外。如果在输精后3-4天期间收集，受精卵绝大多数还未移到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法。用注射器吸取冲洗液连接穿刺针头吸取冲洗液连接注射针头，在子宫角前端刺入，再送入输卵管峡部，注入冲洗液。如果在输精5天后收集，还必须作子宫角取卵。可在子宫角中段插入橡胶双套管，从外管送入空气，使橡皮管顶端的气球膨大紧贴子宫内壁，橡皮管的另一端连接集卵器，然后从子宫角前端插入针头，注入冲洗液3-4次，尽量把冲洗液全部收回在试管或平皿中。2.9.2非手书法移植（如图4）非手术法是在输精后5-7天进行。可采用二路或三路导管的冲卵器。二路式冲卵器由带气囊的导管与单路管组成。导管中一路为注入和回收冲洗液用。导管用直肠把握法从子宫颈导入子宫角。通过气囊导管打入空气，使气囊膨胀以固定导管在子宫角内的位置和防止冲洗液倒流。冲洗液经单路管注入子宫角，每次15-50毫升，然后将冲洗液收集在漏斗形容器内。冲洗5-6次。为更多地回收冲洗液，可在直肠内轻轻按摩子宫角。一般来说，用非手术法移植不如手术成功率高，因为容易损伤子宫角引起炎症，使胚胎不能顺利附植。非手术法成功率为25％-45％，而手术法可达60％-65％。3胚胎的体外生产胚胎的体外生产除超数排卵和胚胎采集技术外，胚胎体内生产中的其它技术都可配合使用，目前，牛胚胎的实验室培养技术主要有两种方法。一种是共同培养系统，另一种是人工合成输卵管液MR)培养系统。相对而言，共同培养系统操作复杂、奶牛胚胎移植及相关技术应用研究费时、费力。因为该系统首先必须在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。而SOFO培养系统的操作比较简单，且经过近年来的研究和完善，培养效果己达到甚至超过共同培养系统。实验室生产胚胎的技术是一项复杂的系统工程，全部过程包括：卵母细胞的采集、卵母细胞的成熟培养，精子的获能处理、精卵的受精培养和胚胎的发育培养。要想获得理想的实验室胚胎生产效果，必须提高每一步的效率，使整个过程达到最完善的组合。主要的程序有:3.1卵母细胞的准备现卵母细胞的采集方法主要有两种:活体采卵和采集屠宰卵巢卵母细胞。采集时真空泵的负压、采卵针的直径大小、甚至针尖斜面的长度等等因素均可影响采集卵母细胞的质量。目前研究表明，牛卵巢采卵时采用负压40--50汞柱、针头为18号针的采卵效果比较理想，此外卵泡的直径大小也影响体外胚胎的生产效果，太大或太小的卵泡均不宜采集。卵泡的直径一般为2-7mm比较适宜。从屠宰场或奶牛场收集到良种奶牛卵巢用保温瓶在29.5-30.5℃的生理盐水中浸没运回实验室。操作前用肥皂清洗双手，再用手清洗卵巢，尽量将卵巢上的血液洗净。用真空泵或注射器吸取卵巢上直径2-6mm的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体(cocs)放入事先添加吸卵液的试管中(试管放置在30-35℃的恒温孔中)。3.2卵母细胞的体外成熟培养(IVM)3.2.1IVM培养小滴的制备在吸取卵母细胞前至少2h制备1VM小滴。IVM小滴的制备必须在超净工作台操作。用微量移液器吸取40ulIVM培养液，滴于直径60mm的培养皿中，每个培养皿制备10小滴IVM。小滴制备完毕后，覆盖上矿物油。在培养皿盖上标记培养液名称、制备日期和操作者姓名，放入CO2,培养箱中平衡至少2h.平衡条件为39℃,5%的C02的空气。3.2.2卵母细胞的洗涤和成熟培养卵母细胞的成熟培养一般采用TCM-199为基础液，添加血清、促性腺激素(FSH/LH)、雌激素(E2170)等〔例如:1096FCS+IOIU/mIFMSG+IOIU加IHCG+TCM-199奶小胚胎移植及相关技术应用研究(含Earle盐液)〕，模拟卵泡环境，加速卵母细胞的成熟发育。另外一些研究发现，在基础液中加入发情牛的血清后，不需在加添加激素，卵母细胞的成熟培养效果较好。不同的实验，其卵母细胞成熟培养时的IVM小滴大小也不同。有些实验采用多孔微板，甚至小试管作为培养器材，培养液体积为0.6-1.Oml;而有些实验采用在普通的培养皿上制作10-100ul的微小滴，进行各种体外培养。培养滴中的卵母细胞数量也各不相同，一般为10-15枚。最近有研究人员用l0ulIVM微滴建立起了培养单个卵母细胞的方法。培养条件为39℃,5%C02,.成熟培养时间，牛为24h.所有操作必须在显微镜恒温台上(38℃)和恒温箱中(38℃)进行，并保持室温在25℃左右，在大培养皿中加入吸卵液后，用2ml的巴氏玻璃管从试管底部吸取卵母细胞，置入培养皿中。在显微镜下查找卵母细胞，将可用卵母细胞移置加有H199+10%FCS的35m培养皿中。将卵母细胞再在B199+10%FCS的培养皿中洗涤一次，立即将卵母细胞转移至IVM培养小滴中(10个卵母细胞/小滴)进行成熟培养。培养条件为39℃,5%的CO2的空气。培养时间为24h。3.3卵母细胞的体外受精(IVF)3.3.1IVF培养小滴的制备用微量移杯吸管取30ullVF的培养液，在60mm培养皿中制备10个IVF小滴，覆盖上矿物油，在39℃,5%C02的培养箱中平衡至少2h。3.3.2精子的获取处理动物体外授精使用的精子为鲜精或冻精。在体外受精过程中，精子必须经过处理。精子的预处理是离心洗涤，以除去褚子表面的去能因子等物质。目前精子的预处理方法有漂浮法(SWIN-UP)和PERCOLL密度梯度离心法两种。获能液和受精液是以BO液为基础液。BO液成分为l0×贮存液:每looml含6.545gNaCl,0.29978gKCI,0.1145gNaH2PO4·H20,0.1057gMgCl·6H20,0.3308gCaCl·2H20,葡萄糖2.5181g,青霉素500lu,链霉素125mg.工作液(临用前配制):NaHCO337mmol，丙酮酸钠1.25mmol,l0×贮存液l0ml洗精液:BO工作液50ml，咖啡因l0mmol受精液:BO工作液l00m1,肝素2mg,BSA2g。以上各液均应过滤后4℃保存备用。将精子经洗精液洗涤后，稀释、计数制成密度为4-8X104/ml的精子悬液。再将卵母细胞移入50ul受精滴中进行受精。PERCOLL密度梯度离心法的具体操作如下:事先在超净的工作台制备90%和45%的PERCOLL液，备用。在15毫升离心管中加入2毫升45%的PERCOLL液，制备成二层PERCOLL梯度液。将一只解冻液(冷冻活力一般需在0.5以上)沿试管壁漫漫奶牛胚胎移校及相关技术应用研究加入离心管中，在700g下(2200转/min)离心至少20mino离心后，马上用巴氏吸管吸取PERCOLL上清液，弃掉。然后，再沿管壁漫漫加入HSOF液1m1,轻轻摇晃离心管，使其混合后，再200g下(1200转/min)再离心15min。弃掉上清液，加入200ullVF培养液。取10ul精子制备液，将其加入190ul蒸馏水中，混合均匀，取该精子液在血球记数板上测定精子密度。根据精子密度确定需要补充的IVF液，以便使精子的最终受精密度达到4-8X104/ml(计算公式可参考有关精子密度测定法)。3.3.3精子和卯母细胞体外受精的培养将成熟卵母细胞从IVM小滴中取出，在HSOF液中洗涤一次。然后用lOulIVF液，将卵母细胞移至IVF小滴中。在加入l0ul处理后的精子液体，使精子的受精密度达到4-8X104个/ml。最后放入培养箱中，在39℃,5%CO2,的空气条件下培养24-26h。3.4受精卵的发育培养(IVC)3.4.1IVC小i商的制备用微量移液器在超净工作台上吸取20ulESOF(用与早期胚胎培养的人工合成输卵管培养液)，在35mm培养皿上制备IVC小滴。通常每个培养皿制备5滴IVC小滴，中间一滴为40ulIVC，用于洗涤胚胎。IVC小滴制备后，攫盖矿物油，置于充满5%CO2,7%02，88%氮气的密闭罐中平衡至少2h，平衡温度为39℃。3.4.2受精卵的发育培养受精卵培养24-26h后，将受精卵移入HSOF中，用微量移管反复吹吸受精卵，除去受精卵周围的颗粒细胞。然后将受精卵移置IVC洗涤小滴中，在转入IVC培养小滴中，每小滴受精卵数为10-15枚。然后将培养皿放入充满溅COY,浅仅、88%氮气的密闭罐中，在温度为39摄氏度培养箱中培养。在胚胎培养的第5天(受精当天为Od)，必须将胚胎移置LSOF(晚期培养液)中继续培养2-3d<LSOF培养小滴的制备同上。在第5天转移胚胎时，将未卵裂的卵母细胞留在中央的LSOF洗涤小滴中，并可记数卵裂情况。4供体和受体的术后观察不论用何种方法移植胚胎，供体和受体的发情期应相同或前后相差不超过24小时，否则，将会影响成功率。所以在胚胎体外保存方法没有得到较好的解决之前，必须对供体和受体同时进行同期发情处理，使两者性腺和生殖道处于相同的生理状态，以提高移植成活率。对供体和受体于术后要注意观察是否发情。供体发情时即可正常配种，或经过40-80天再重复作为供体。受体母畜如未发情，在适当时间进行妊娠检查。若确已妊娠，应加强饲养管理。诱产双胎的受体母畜以成年母畜较好，可以减少分娩困难。5胚胎移植的实际效果和影响因素供体取决于成年动物体内环境与外界多种措施及胚胎的质量如何，受体主要是与供体发情同步化程序，受体的黄体功能﹑品种﹑年龄﹑精子的质量﹑胚胎保存过程中的技术水准移植人员的技术水平及移植的部位﹑受体牛发情鉴定的准确性﹑移植后受体母牛的饲养管理﹑手术损伤及外界多方面因素，都影响成功率；胚胎质量和发育期对移植成功也有直接的关系，发育延迟和变性胚胎移植成功率很低，胚胎移植在普通温度下进行成功率高，在高温情况下移植的成功率很低，所以胚胎回收后，应尽快移植，才能获得较高的胚胎发育率。新鲜一级和优级胚及自然发情受体受胎率50-60%﹑新鲜一级和优级胚及同期发情受体受胎率40-50%﹑体内一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率35-45%﹑体内一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率30-