第十章 色谱分析法导论

第十章色谱分析法导论第一页，共六十八页，2022年，8月28日“色谱法”名称的由来石油醚(流动相)碳酸钙(固定相)}色谱带俄国茨维特一概述第二页，共六十八页，2022年，8月28日是利用混合物不同组分在固定相和流动相中分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。色谱法色谱分离实质差速迁移第三页，共六十八页，2022年，8月28日色谱法的分类根据流动相的物态可分为气相色谱(GC)液相色谱(LC){第四页，共六十八页，2022年，8月28日根据固定相的外形分柱色谱平板色谱平板色谱填充柱色谱毛细管柱色谱纸色谱薄层色谱第五页，共六十八页，2022年，8月28日根据分离机理可分为吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱第六页，共六十八页，2022年，8月28日色谱法的特点和应用1.分离效能高2.灵敏度高可检测10-11~10-13g,适于痕量分析.色谱分析需试样量极少(g或ng).3.分析速度快4.应用范围广 缺点：对未知物的定性分析比较困难。方向：高选择性检测器；联用技术（GC-MS、GC-FTIR、LC-MS、LC-NMR等）。第七页，共六十八页，2022年，8月28日二色谱分离原理慢中等快淋洗液第八页，共六十八页，2022年，8月28日1、分配系数（平衡常数）K

指在一定和温度和压力下，组分在两相间达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度cs与组分在流动相中的浓度cm之比。K：与温度、压力有关外，还与组分性质、固定相和流动相性质有关。

不同组分K值的差异，是实现色谱分离的先决条件。第九页，共六十八页，2022年，8月28日2、容量因子（分配比）k

指在一定温度和压力下分配系数与容量因子关系：第十页，共六十八页，2022年，8月28日称为相比k：与温度、压力有关外，还与组分性质、固 定相和流动相性质及有关。

K与k是两个不同的参数，但在表征组分的分离行为时，二者完全等效。k可以方便地从色谱图直接求得，所以它是一个重要的色谱参数。第十一页，共六十八页，2022年，8月28日三色谱图及常用术语第十二页，共六十八页，2022年，8月28日1、基线

当没有待测组分进入检测器时,在实验操作条件下，反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。2、峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。第十三页，共六十八页，2022年，8月28日3、区域宽度

用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法:1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽W1/2---即峰高一半处的峰宽度。它与标准偏差的关系为:W1/2=2.3543.峰底宽度Wb--即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是

Wb=4第十四页，共六十八页，2022年，8月28日4、保留值(1)死时间tM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间.L为柱长(cm)ū为流动相平均线速度(cm/s)(2)保留时间tR

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间.第十五页，共六十八页，2022年，8月28日(3)调整保留时间tR´

tR´=tR

tM

由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。

保留时间是色谱法定性的基本依据.

但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。第十六页，共六十八页，2022年，8月28日(4)死体积VM

不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积.

VM=Fc·tM

Fc:流动相平均体积流速,（单位:cm3·min-1）.(5)保留体积VR

指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

VR=Fc·tR(6)调整保留体积VR

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

VR=VR

VM=tRFc第十七页，共六十八页，2022年，8月28日（7）相对保留值

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。

第十八页，共六十八页，2022年，8月28日

在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数，称选择因子，用符号表示，即 式中tR(2)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。可作为衡量固定相选择性的指标。

越大，越容易分离。=1，分离不能实现。

第十九页，共六十八页，2022年，8月28日第二十页，共六十八页，2022年，8月28日从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：

(1)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；

(2)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；

(3)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；

(4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；

(5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。第二十一页，共六十八页，2022年，8月28日

下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。

浓度沿柱移动距离LABABKA>KB若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。四、色谱基本理论第二十二页，共六十八页，2022年，8月28日

第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。第二十三页，共六十八页，2022年，8月28日一塔板理论-柱分离效能指标

塔板理论的假设：

(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。

1.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；第二十四页，共六十八页，2022年，8月28日

色谱柱长：L，

虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H第二十五页，共六十八页，2022年，8月28日

塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n

约为103-106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：

式中tR

与Y1/2(Y)应采用同一单位（时间或距离）。

tR

一定时，色谱峰越窄，n越大，H越小，柱效能越高。第二十六页，共六十八页，2022年，8月28日

在实际工作中，计算出来的

n

和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：有效板高：组分在tM时间内不参与柱内分配第二十七页，共六十八页，2022年，8月28日

在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。比较柱效时，必须把操作条件固定下来，用同一种物质通过不同的色谱柱,分别计算出n有效进行比较.第二十八页，共六十八页，2022年，8月28日用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置提出了计算和评价柱效的参数一种半经验性的平衡理论塔板理论贡献缺点不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素不能说明同一溶质为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数第二十九页，共六十八页，2022年，8月28日二速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。第三十页，共六十八页，2022年，8月28日

vanDeemter方程的数学简化式为

ū为流动相的平均线速度，单位：cm/s；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。第三十一页，共六十八页，2022年，8月28日1涡流扩散项

A

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。（动画）第三十二页，共六十八页，2022年，8月28日2.

分子扩散项—B/ū（纵向扩散项）：弯曲因子，填充柱色谱，<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）。与组分性质、载气性质、柱温、柱压等因素有关。（动画）

(1)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(2)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。第三十三页，共六十八页，2022年，8月28日3.传质阻力项Cū

物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程，称为传质。影响该过程的阻力，称为传质阻力。

传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项，即C=Cg+C1

（动画）第三十四页，共六十八页，2022年，8月28日

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。

采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。第三十五页，共六十八页，2022年，8月28日

液相传质过程是指试样组分气/液界面分配时形成的

降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。 当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。虽然提高柱温可增大D1，但会使k值减小，为了保持适当的C1值，应控制适宜的柱温。第三十六页，共六十八页，2022年，8月28日

当固定液含量较高，液膜较厚，载气以在中等的线速下时，板高主要受液相传质系数Cl的控制。此时，气相传质系数值很小，可以忽略。然而，随着快速色谱的发展，当采用低固定液含量柱和高载气线速进行分析时，气相传质阻力就会成为影响塔板高度的重要因素。第三十七页，共六十八页，2022年，8月28日将上面式总结，即可得气液色谱板高方程

这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。第三十八页，共六十八页，2022年，8月28日4.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。第三十九页，共六十八页，2022年，8月28日最低点：第四十页，共六十八页，2022年，8月28日三、分离度1、柱效和选择性

理论塔板数n是衡量柱效的指标，反映了色谱分离过程动力学性质。

选择性因子是衡量色谱柱选择性的指标，取决于组分在固定相上的热力学性质。第四十一页，共六十八页，2022年，8月28日2、分离度的定义 分离度又叫分辨率或分辨度，既能反映柱效率又能反映选择性的指标，是衡量分离效能的总指标。

定义：或第四十二页，共六十八页，2022年，8月28日不同分离度时色谱峰分离的程度一般说，当Rs<1时，两峰有部分重叠；当Rs=1时，分离程度可达98%；当Rs=1.5时，分离程度可达99.7%。

通常用Rs=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。第四十三页，共六十八页，2022年，8月28日3、分离度的公式

分离度受柱效（n）、选择因子（α）和容量因子（k'）三个参数的控制。设有两相近色谱峰A、B，同时假设Wb(A)=Wb(B)。

基本色谱分离方程式第四十四页，共六十八页，2022年，8月28日(1)分离度与柱效的关系 增加柱长，可提高分离度，但延长了分析时间，因此降低板高，提高柱效，才是提高分离度的好方法。第四十五页，共六十八页，2022年，8月28日(2)分离度与选择因子的关系

=1时，R=0

大，选择性好。研究证明的微小变化，就能引起分离度的显著变化。

一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。第四十六页，共六十八页，2022年，8月28日(3)分离度与容量因子的关系

一般取k为1~5最宜。对于GC，通过提高温度，可选择合适的k'值，以改进分离度。而对于LC，只要改变流动相的组成，就能有效地控制k'值。它对LC的分离能起到立竿见影的效果。第四十七页，共六十八页，2022年，8月28日1）.利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。六、色谱定性和定量鉴定方法1、定性方法第四十八页，共六十八页，2022年，8月28日

2）.利用文献保留值定性

利用相对保留值r21定性相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。第四十九页，共六十八页，2022年，8月28日3）.保留指数

又称Kovats指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：第五十页，共六十八页，2022年，8月28日保留指数计算方法100Z100(Z+1)IXlgtR’(Z)lgtR’(i)lgtR’(z+1)第五十一页，共六十八页，2022年，8月28日4.与其他分析仪器联用的定性方法小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第五十二页，共六十八页，2022年，8月28日2、定量分析定量基础或第五十三页，共六十八页，2022年，8月28日1）、响应信号的测量（1）对称形峰面积的测量——

峰高乘以半峰宽法

A=1.065hW1/2（2）不对称形峰面积的测量——峰高乘以平均峰宽法

A=1/2h（W0.15+W0.85）第五十四页，共六十八页，2022年，8月28日（3）自动电学积分仪（4）用峰高表示峰面积在痕量分析中，峰高法的准确度较高。峰面积法适用于各种形状的峰，精度较好。

峰面积的大小不易受操作条件如柱温、流动相的流速、进样速度等的影响，故适于作定量分析的参数。第五十五页，共六十八页，2022年，8月28日2）、校正因子

（1）绝对校正因子

受仪器及操作条件影响很大，使用受到限制。（2）相对校正因子 定义：i：组分S：标准物质

相对校正因子可以把各个组分的峰面积分别换算成与其质量相等的标准物的峰面积，则比较标准统一起来。m:g,mol,Vf:fm,fM,fV第五十六页，共六十八页，2022年，8月28日

（3）相对校正因子的表示方法 组分和标准物质都是以质量表示的，称为相对质量校正因子；若以摩尔为单位，称相对摩尔校正因子；若以摩尔为单位，称相对体积校正因子；

通常所指的校正因子都是相对校正因子。第五十七页，共六十八页，2022年，8月28日2）常用的几种定量分析方法(1)归一化法试样中所有组分的含量之和按100%计算第五十八页，共六十八页，2022年，8月28日试样中所有组分均须出峰要求操作条件如进样量、载气流速等变化时对结果的影响较小。优点当各组分的fisA相近时，可