野菊花总黄酮提取工艺的研究

野菊花总黄酮提取工艺的研究摘要：采用超声辅助法提取野菊花中总黄酮，通过单因素分析和正交分析实验确定野菊花总黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明：野菊花中总黄酮的最佳条件是料液比1:20，60%（体积分数）乙醇浓度，提取温度70℃，提取功率60w，提取时间50min。野菊花(学名:Dendranthemaindicum)是菊科的一种多年生草本植物，野菊花的花和菊花相似呈棕黄色，其叶、花及全草入药。根据野菊花的化学成分研究表明，野菊花中主要含有丰富的挥发油类物质，萜类物质，有机酸，黄酮类物质及其他成分。传统的提取方法和大部分中药提取类似，有水蒸气蒸馏法，超声辅助提取法，微波提取法和加热回流提取法等。大部分成分由于其物理性质决定其加热不稳定，在加热或者浓缩过程中易于挥发或降解，损失许多有效成分。采用传统方法无可避免消耗大量溶剂，提取效率低下，污染环境，能耗大等的通病。因此，亟待发现一种新的，高效的，稳定环保的提取与方法。黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。黄酮类包括木樨草素、刺槐素、蒙花苷、芹菜素、金合欢素、槲皮素、异泽兰素等成分[1.2.3.4]。目前提取植物体重总黄酮常见的方法有溶剂浸提法，酶辅助提取法和超声辅助提取法，超声辅助提取法因具有简单、安全、高效等优点而备受关注［5］。单科开［6］等人以干苦菜为原料，采用超声波－乙醇提取法提取苦菜总黄酮，通过响应面法对提取工艺条件进行优化，在优化后的工艺条件下，苦菜总黄酮理论得率为3.71%。本实验以野菊花为原材料，采用超声辅助法提取野菊花中总的黄酮，并优化提取工艺条件。1材料与仪器1.1材料与试剂野菊花：购自中国药品生物制品检定所，货号120995，批号：120995-201707，本品为菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.干燥头状花序的粉末，系供中国药典2015版一部野菊花，野菊花栓。西林瓶1G/支芦丁标准品：100080中国药品生物制品检定所氢氧化钠：R015000氢氧化钠,AR,96%罗恩试剂亚硝酸钠，95%乙醇，硝酸铝，石油醚等 1.2主要仪器电子天平：JA1003N,上海精密科学仪器有限公司高速粉碎机：AF-04A温岭市奥力中药机械有限公司鼓风干燥箱：DHG-9015A上海一恒科学仪器有限公司真空抽滤装置，布什漏斗，抽滤瓶，烧瓶，试管，移液器：津腾烘箱：PH-010(A)上海一恒科学仪器有限公司循环水式真空泵：SHZ-DⅢ上海力辰仪器科技有限公司可见光分光光度计：V-1200B上海美谱达仪器有限公司超声波清洗仪：HU10260D 天津市恒奥科技发展有限公司索氏提取仪：上海精密仪器仪表有限公司SXT系列离心机：湘仪离心机仪器有限公司型号：L535-12方法2.1野菊花预处理工艺野菊花→脱脂脱色（先在石油醚中浸泡）→抽滤→烘箱干燥（50℃）→避光保存备用2.2野菊花总黄酮的提取2.2.1工艺流程野菊花→烘干→磨碎→脱色（索氏提取法，石油醚脱色）→提取→过滤→定容→离心→总黄酮提取液。2.2.2具体实验过程具体实验：准确称取1.0000g野菊花样品5份于烧杯中，加入一定浓度的乙醇溶液若干毫升，于一定超声时间、超声温度、超声功率的条件下超声辅助提取，过滤，定容，离心，将上清液吸取1mL，定容至5mL，摇匀，然后吸取0.5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠4mL，加50%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，测定吸光度，代入回归方程计算出黄酮含量，并计算总黄酮得率。2.3样品液的制备将野菊花粉末用索氏提取方法进行脱色。称取脱色后的野菊花粉末1g，以50%的乙醇水溶液为提取剂，超声辅助提取，得提取液过滤后定容，在2000r/min的转速下离心20min，取上清液，得待测样品。2.4芦丁标准曲线的绘制根据文献[6]：先用70%（体积分数）乙醇溶液配制0.2mg/mL的芦丁标准溶液，再准确吸取0.0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0mL,0.2mg/mL芦丁标准溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，摇匀备用。吸取1.0mL标准溶液于10mL的比色管中，加入0.3ml的5%（体积分数）亚硝酸钠溶液摇匀，静止6min，随后加入0.3mL的10%（体积分数）的硝酸铝溶液，摇匀，静置6min，再加入4.0mL的4%（体积分数）的氢氧化钠溶液，然后用70%（体积分数）乙醇溶液定容至10mL，摇匀后放置反应15min，以70%（体积分数）乙醇溶液作为空白对照，于510nm处测定溶液吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为：A=11.35×C-0.1037，R2=0.9987,说明在此浓度范围内，吸光度与芦丁标准品的浓度具有较好的线性关系。2.5提取物的指标控制根据前期研究，初步确定野菊花的有效部位是其非极性部位，但是缺少有效成分指标，本次以提取率作为指标来研究其工艺参数的影响。按照L16（45）正交表设计优化方案，通过计算公式计算出各方案中野菊花非极性部位提取物的提取率。料液比：取1.0000g野菊花粉末,按照不同料液比1:15（g/mL）,1:20,1:25,1:30与50%乙醇混合，提取功率30W，40℃下超声提取30min乙醇浓度：取1.0000g野菊花粉末,按照料液比1：15（g/mL）分别与50%，60%，70%，80%的乙醇混合，提取功率30W，在60℃下超声提取30min，分析乙醇浓度对野菊花中总黄酮提取率的影响提取温度：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）与50%乙醇混合，提取功率30W，分别在40℃，50℃，60℃，70℃下超声提取30min，分析温度对野菊花中总黄酮提取率的影响提取功率：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）与50%乙醇混合，提取功率分别是30w，40w，50w，60w，在60℃下超声提取30min，分析提取功率对野菊花中总黄酮提取率的影响提取时间：取1.0000g野菊花粉末，按照料液比1：15（g/mL）与50%乙醇混合，取功率30w，60℃超声提取时间分别是30min，40min，50min，60min，分析超声提取时间对野菊花中总黄酮提取率的影响根据影响CO2超声辅助提取的因素，选取料液比（A）乙醇浓度（B）,提取温度（C），提取功率（D）,提取时间（E）,作为实验依据，设置四个水平条件，以总黄酮为指标，选用L16（45）正交表进行实验，各因素水平条件见表1表1因素水平条件表水平条件料液比A因素B乙醇浓度因素C提取温度/℃因素D提取功率/W因素E提取时间/Min11:1550%40303021:2060%50404031:2570%60505041:3080%7060602.6野菊花中总黄酮得率的测定吸取1ML的待测样品，定容至5ML，充分摇匀，吸取0.5ml，加入5%亚硝酸钠溶液0.3ML，摇匀，静置6min，加入0.3ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min，加入4%氢氧化钠4ml，加50%乙醇至刻度线，摇匀，静置15min，测其吸光度，带入回归方程式算出黄酮含量，并计算总黄酮得率。3.结果与分析3.1料液比对野菊花中总黄酮提取率的影响当料液比（g/mL）分别为：1:15、1:20、1:25、1:30时，提取率为7.531%、7.953%、7.135%、7.101%。由结果可知，野菊花中总黄酮的提取率随料液比的增加而增大。当料液比大于1:20后，黄酮提取率逐渐下降，这是因为溶剂用量增大时，溶剂中的有效成分浓度低，与物料及溶剂边界层的有效成分浓度差大，扩散推动力大，因而提取率高。从提取效果、减少溶剂用量等方面综合考虑，溶剂用量不宜过大，因此选择料液比为1:20。3.2乙醇浓度对野菊花总黄酮提取率的影响当乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%时提取率为7.943%、8.019%、8.179%、7.858%。由结果可知，随着乙醇浓度的增大，黄酮类化合物提取率也随着增大，但当乙醇浓度较高时脂溶性物质溶出量也增大，从而导致提取率的降低。同时干扰因素随之增多，给后续的提纯带来困难，因此确定乙醇浓度为60%为宜。3.3超声温度对野菊花总黄酮提取率的影响当超声温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃时提取率为7.837%、8.196%、8.252%、7.847%。由结果可知，随着超声温度的升高总黄酮提取率增长，温度超过60℃，提取率降低。温度过高，一方面其中的活性成分会受到破坏，杂质的溶出量增加。给后续的操作带来不便，成本费用增加；另一方面也会造成溶剂损失。综合以上两方面的因索，提取时适宜的温度应定为60℃。3.4提取功率对野菊花总黄酮提取率的影响当超声功率从30w、40w、50w、60w时，提取率为7.121%、7.426%、7.537%、7.544%。由结果可知，随着超声功率的升高总黄酮提取率增长，且对提取率的影响不大，节能考虑选择超声功率60w。3.5超声时间对野菊花总黄酮提取率的影响当超声时间分别为30、40、50、60min时提取率为7.164%、7.436、7.812%、7.445%。由结果可知，总黄酮的提取率随着提取时间的增长而增高，当提取时间大于50min，提取率下降，结合提取率和时间，选择最佳提取时间为50min。3.6正交实验结果表2正交实验因素水平设计表水平A料液比B乙醇浓度C提取温度/℃D提取功率/w提取时间/min11:1550%40303021:2060%50404031:2570%60505041:3080%706060表3正交实验分析表表4方差分析结果由表3表4结果分析，得出如下结论：影响总黄酮提取率的主次关系是A＞C＞E＞D＞B。方差分析表明，A（料液比）对野菊花总黄酮提取率的影响具有显著统计学意义，为主要因素，其余影响为次要因素。根据实验结果分析，最佳组合是A2B2C4D4E3,即超声波辅助提取野菊花总黄酮的最佳条件是料液比1:20，60%（体积分数）乙醇浓度，提取温度70℃，提取功率60w，提取时间50min。3.8验证试验为了进一步考察上述优选工艺的稳定性，按上述的最佳条件：料液比1:20，60%（体积分数）乙醇浓度，提取温度70℃，提取功率60w，提取时间50min，进行三次平行实验。紫外分光光度法测定，代入标准曲线，计算其提取率，结果总黄酮提取率可达到8.013%，说明此工艺有一定的可行性。用超声辅助提取野菊花中黄酮的最佳工艺条件为料液比1:20，60%（体积分数）乙醇浓度，提取温度70℃，提取功率60w，提取时间50min。超声技术应用能提高有效成分的溶出速度、缩短提取时间、节省溶剂的消耗、提高提取率。3．讨论超声波是指频率高于2*104HZ的声波,属机械波的一种,由于超越了人类听觉的上限,故称为超声波。超声化学是声学和化学相互交叉渗透的一门新的学科,作为一门边缘性交叉学科,年代以来发展十分迅猛。随着功率超声波理论研究的深入和仪器设备制造技术的日趋完善,超声化学技术广泛应用于食品检测和食品加工、化工、医疗、生物工程等许多领域[7-13]超声辅助提取技术室利用超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波的次级效应，如机械振动，乳化，扩散，击碎，化学效应等也能加速待提取物的扩散释放并加快与溶剂的混合，提高药物溶出速度和溶出次数。与常规提取法相比，提取时间短，一般一个小时之内就能提取完成，提取率高，是普通方法的2-3倍，低温提取更是有利于保存易挥发，不稳定成分等优点。Toma等（2001）[14]对超声辅助提取酸橙、茼香种子、骆驼蓬属种子、啤酒花球果、土木香根、薄荷叶等7种植物材料中的活性物质进行了研究，主要考察了超声处理与传统的提取方法对几种植物材料溶胀系数、提取含量和细胞结构的变化。结果表明超声处理1h金盏花、酸橙、酋香种子、骆驼蓬属种子、啤酒花球果、土木香根、薄荷叶吸水的体积分别为6、5、4、3、3、2.5、2.5mL,溶胀率分别增加了27、20、100、60、43、55、38%。而提取溶剂对提取含量有最直接的影响，但是超声处理后提取物的含量均比浸泡提取的高。此外，通过扫描电镜图片观察了超声处理后对植物材料细胞组织结构的影响，发现植物组织的细胞结构明显被破坏，提取成分从植物材料快速溶入到提取溶剂，首次从细胞结构的角度解释了超声强化的机理。Paniwnyk等（2001）[15]进行了槐树花牙中芦丁的超声增强提取，发现不当的超声处理导致提取量的下降。Li等(2004)[16]研究了超声增强大豆油的提取，同样利用大豆粉末细胞组织结构的电镜图片解释了超声增强的机理。Vinatoru(2001)[17]比较全面的综述了超声辅助提取芸香科植物活性物质的研究，文章中详细介绍了提取溶剂的选择、超声参数对提取过程可能产生的影响以及超声增强的原理、超声提取技术的优势以及研发规模化超声设备的要求。Knorr(2003)[18]对植物有机代谢物的非热处理方法进行了综述，认为超声辅助提取植物代谢物以及在加工功能性食品的非热预处理等方面有巨大的应用潜力；Wang等[19]综述了各种提取方法应用于提取植物材料中营养成分的研究进展，比较了各种方法的优缺点以及未来的发展方向，并探讨了开发快速、有效、环保等优势的提取技术的应用前景和市场潜力。Vilkhu等(2007)[20]对超声辅助提取动植物材料中的多酚、多糖、花色昔等多种功能性成分的研究报道及其今后在食品加工领域的发展前景进行了综述，提出了超声规模化提取活性物质的一些关键问题：（1）植物材料细胞组织结构特性；（2）提取成分在植物组织中所在的部位；（3）超声提取前对植物组织的处理；（4）提取成分的理化性质；（5）超声对植物材料表面的破坏及生物量转变的影响、扩散作用、减少提取时间、增加提取效率等等。Patist等（2007）[21]探讨了超声波技术在食品领域内可能的商业化应用以及工业化规模生产面临的挑战及其未来的发展趋势，特别对超声波加工技术实现商业化应用充满了信心。本文根据影响超声辅助法提取野菊花中总黄酮的因素，选取料液比（A）乙醇浓度（B）,提取温度（C），提取功率（D）,提取时间（E），作为实验依据，设置四个水平条件，以总黄酮为指标，选用L16（45）正交表进行实验。实验结果表明：最佳组合是A2B2C4D4E3,即超声波辅助提取野菊花总黄酮的最佳条件是料液比1:20，60%（体积分数）乙醇浓度，提取温度70℃，提取功率60w，提取时间50min。[1]崔兰冲,李小芩,韩莹,李发美.HPLC测定野菊花中蒙花苷与木犀草素的含量[J].2007,32（1）：3[2]戴胜，张明，程文明，张勋，张群林，李俊.HPLC测定野菊花药材中8种黄酮和有机酸的含量[J].2013,38（12）：5[3]元琦，李新民，王月伶，等.β-环糊精修饰区带毛细管电泳法测定野菊花中刺槐素、木樨草素和槲皮素[J]理化检验（化学分册），2005(7):464[4]吴钉红，杨立伟，苏薇薇.野菊花化学成分及药理研究进[J]中药材，2004，27（2）：142[5]杨昱，白靖文，俞志刚．超声辅助提取技术在天然产物提取中的应用[J]．食品与机械，2011,27（1）：170-174[6]钟姣姣，李万林.菊花中总黄酮微波辅助提取工艺条件研究[J].西部皮革，2014，36（12）15-21[7]单科开，王鸿飞，许凤，罗洁，韩爱茹，李艳霞，邵兴锋，韦莹莹，苦菜总黄酮超声波辅助提取及抗氧化能力研究[J]，2019，33（9）1755-1764[8] 刘东红液态食品超声传播特性及品质超声检测技术的研究［博士学位论文］．杭：州浙江大学，2006.[9] 谷勋刚超声波辅助提取新技术及其分析应用研究［博士学位论文］．安徽：中国科技大学，2007.[10] Cocciardi.R.A,Ismail.A.A,Sedman.J.Investigationofthepotentialutilityofsingle-bounceattenuatedtotalreflectancefouriertransforminfraredspectroscopyintheanalysisofdistilledliquorsandwines.JournalofAgricultureandFoodChemistry.2005,53:28032809.[11] 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