生物物理课-3教学课件

3.膜的合成与分选MedicineNobelgoestopioneerofproteinguidancemechanismsNature401,625(1999)Howdotheproteinsknowwheretogo?Howdotheymaketheirway?----NatureGunterBlobel细胞中自组装和自组织问题的重要课题之一是物质的分选、定向和转运，是细胞自组装自组织过程的第一步..#IndividualProteinsaretransportedwithinthepatternaccordingtointrinsicsignals.Signalsequences---initiatetranslocationofproteinsacrossspecificmembranes.Stop-transfersequences---interruptthetranslocationprocessthatwaspreviouslyinitiatedbyasignalsequence.Sortingsequences---actasdeterminantsforposttranslocationaltrafficofsubpopulationsofproteins.Insertionsequences---initiateunilateralintegrationofproteinsintothelipidbilayerwithoutthemediationofadistinctproteineffector.-------GunterBlobel(PANS77,1980,1496-1500)蛋白质分选存在不同层次由线粒体和叶绿体DNA编码的蛋白，则在这些细胞器的核糖体中合成，因此这些蛋白就直接编入线粒体和叶绿体空间里(compartment)。在真核细胞中，大多数线粒体和叶绿体蛋白，以及其它细胞器、颗粒和膜的蛋白都是由核DNA编码，并在胞浆核糖体中合成的。将这些蛋白分选到其正确的方向，就需要多重的分选信号及多步的分选活动。蛋白质分选存在不同层次对于在胞浆中合成的蛋白质分选在粗面内质网上膜束缚的核糖体(membrane-attachedribosomes)上合成的蛋白。未附着膜上的胞浆核糖体(membrane-unattachedribosomes)合成的蛋白。蛋白质分选存在不同层次对于未附着在膜上的胞浆核糖体中合成的蛋白合成后被释放到胞浆中，其中一些蛋白仍保留在胞浆中，而另外一些则被编入细胞核、线粒体、叶绿体或过氧化酶体中，然后再进一步分选到这些细胞器中的正确方位。

被导向线粒体的蛋白要首先与线粒体外膜胞质侧的特异性受体结合，即输入受体(import-receptor)。许多进入线粒体的蛋白含有一个具有信号功能的前导序列(pre-sequence)，大小从0.5kd到20kd不等。当蛋白定位于线粒体膜上之后此前导序列被切除。

对大量的前导序列的分析发现，它们富含Arg和Lys，并且通常被不带电的氨基酸如Ser和Thr分隔开，几乎不含有酸性氨基酸。这些特征都说明它们是决定蛋白在线粒体上定位的序列.

此外还发现线粒体前体蛋白在特定的内外膜接触区域跨越线粒体的内外膜.蛋白质分选存在不同层次对于在粗面内质网上膜束缚的核糖体上合成并进入分泌途径的蛋白，又可分为两种类型蛋白。一类以共转移形式—即边合成边穿过内质网膜进而进入内质网中腔中的蛋白。另一类为整合膜蛋白(integralmembraneprotein)，这些蛋白的前25个氨基酸组成的序列叫做拓扑序列(topogenicsequences)，用以保证蛋白在插入内质网膜时获得正确的定向。蛋白质合成与分选的分泌途径内质网驻留信号(signalsforretentioninER)

目前一种观点认为，那些将要离开内质网转运到高尔基体、并进一步转运到质膜或溶酶体等细胞器的蛋白，是不需要特定的信号序列的(??，这种观点可能不对!)。而在那些保留在内质网中的蛋白上却发现了一些保守的信号序列—所谓的内质网驻留信号。如，已发现序列lys-Asp-Glu-Leu对三种驻留在内质网中的非膜蛋白是必需的。转运囊泡介导的胞内运输转运囊泡介导的胞内运输对于进入粗面内质网的分泌蛋白，通过转运囊泡把它们转运到高尔基复合体。那些被转运到高尔基体囊泡中的蛋白，其中一部分将继续留在高尔基体中，剩下的则会被运送到溶酶体及各种囊泡中。其中进入分泌囊泡的蛋白经过胞吐(exocytosis)，即分泌小泡的膜与细胞膜融合，将蛋白释放到细胞外Thesecretorypethwayofproteinsynthesis转运囊泡介导的胞内运输第一，转运囊泡是如何形成的，某些膜整合蛋白是如何选择性插入囊泡而其他蛋白却被排除在外？第二，导致特定转运囊泡只结合在特定种类细胞器膜上的分子机制是什么？第三，转运囊泡与靶细胞器膜融合的机制是什么？StageandcomponentsofavesicleshuttleNature396(1998)543Science272(1996)228.Cell97(1999145Cell92(1998)759buddingtargetingfusion转运囊泡介导的胞内运输Budding(出芽):两种包被蛋白参与两类转运囊泡的形成clathrin-coatedvesicles:由笼形蛋白(clathrin)包被的囊泡，形成于plasmamembrane和trans-GolgiNetwork之间。COP-coatedvesicles:COP包被蛋白包括若干种coatmer，其中COP是一种与笼形蛋白重链相似的蛋白。这些非笼形包被蛋白包被的囊泡形成于ER与Golgi之间，以及不同种类的Golgi囊泡之间。笼形蛋白包被囊泡的形成膜整合蛋白选择性编入笼形蛋白包被囊泡过程一个的模型。一些膜蛋白的胞浆结构域特异性结合在组装颗粒上。然后，这些组装颗粒再与笼形蛋白相结合，并与其一起自发地聚集到膜的一个区域。未与组装颗粒结合的膜蛋白则被排除在笼形蛋白包被囊泡之外。位于纤维原细胞膜胞浆侧的笼形蛋白包被凹陷，具有笼形蛋白纤维组成的多面体网状结构。Thecellwasrapidlyfrozeninliquidhelium,freeze-fractured,andthentreatedbythedeep-etchingtechnique.转运囊泡介导的胞内运输Budding(出芽)Targating(导向定位)Fusion(融合)

每一个Rab蛋白都有一个中心结构，其氨基酸序列在所有Rab蛋白中都很相似，这一区域可以结合GTP并将其水解为GDP。接近C-端、约35个氨基酸长的片断，是各种Rab蛋白特异性的，它决定了该种Rab蛋白结合的膜的种类。C-端的半胱氨酸残基，共价结合到聚异戊二烯脂上，通常是20碳的geranylgeranyl。各种Rab蛋白N-端的约20个残基也非常不同。Rab蛋白的通常结构转运囊泡介导的胞内运输Budding(出芽)Targating(导向定位)Fusion(融合)膜融合前转运囊泡与受体medial-Golgi囊泡的结合(Golgi复合体中囊泡转运的细节)两个膜的吸附是由Rab蛋白起始的，并且由转运囊泡膜上的VAMP样蛋白的胞浆结构域与受体囊泡膜上的syntaxin样蛋白的胞浆结构域相结合。三种SNAP蛋白结合到上述复合体上，并进一步结合NSF。然后（步骤5，不知在何处发生），ATP的水解引发了Golgi膜与转运囊泡膜的融合，同时，NSF和SNAPs释放到胞浆中。突触囊泡循环的最关键步骤是膜融合引发的出胞作用。Golgi复合体中囊泡转运的细节cis和medialGolgi囊泡间的转运步骤是通过对非细胞提取物的研究确定的。将cis-Golgi囊泡培育在GTP，ATP，和coatomer中，ARF（1）可以导致非笼形蛋白包被转运囊泡的形成（2）这些囊泡结合到受体medial-Golgi囊泡上（3）。非笼形蛋白包被转运囊泡的去包被（4）需要一种胞浆蛋白Rab及GTP水解为GDP和Pi；实验中若添加不能水解的GTP类似物，则此步骤被阻断。囊泡膜与medial-Golgi膜（5）融合需要ATP的水解和四种胞浆蛋白：NSF和三种SNAPs（溶解的NSF结合蛋白）。添加化学物质NEM（N-ethylmaleimide）可以选择性阻断这一步骤，因为它可以与NSF上关键的SH基团发生反应。

转运囊泡介导的胞内运输VesicleshuttleVesicleshuttleVesicleshuttle膜脂的合成与运输膜脂的生成磷脂在已有细胞膜上结合的酶的催化下合成，并在合成后直接插入该膜中。膜的生成是在已有膜的基础上的延伸。

上述观点可由实验证明，将细胞暂时暴露在放射性磷酸盐或放射性标记的脂肪酸或糖中，则可以看到由这些前体物质合成的放射性磷脂和糖脂全都与细胞内的膜相结合；并没有游离在胞浆中。由此可知，磷脂是边合成边插入膜中的。

所有的细胞中，磷脂都是在膜和胞浆的分界面上合成的。在动物和植物细胞中，大多数磷脂的合成都是与内质网相结合的，通常是滑面内质网。催化合成反应的酶，大多是一端与内质网结合或插入内质网中，而另一端伸入胞浆中。

多数细胞可以利用乙酸盐合成脂肪酸；而许多动物细胞则可以从三酰甘油的水解获得脂肪酸。在动物细胞的磷脂酰乙醇胺合成途径中，其中的一个底物--脂肪酰辅酶A是一种lipid-anchoredprotein，其脂肪酰链埋入内质网膜的胞浆侧(inthecytosolicleafletoftheERmembrane)，辅酶A部分则伸向胞浆中(protrudingintothecytosol)。其它的底物和反应产物，如ATP、乙醇胺、CTP等，则都是胞浆中的可溶性组分。特定的膜蛋白使磷脂在膜两侧平衡

新合成的磷脂分布在内质网的胞浆侧，但不久，大多数磷脂就会如同大部分细胞的膜结构一样，分布到胞浆和非胞浆两侧。在大多数膜中，一个磷脂分子从膜的一侧移动到另一侧(翻转,flip-flop)至少需要几个小时。那么新合成的磷脂是如何快速地从内质网的胞浆侧移动到非胞浆侧的呢?这是由于在内质网膜上(及细菌的细胞膜)含有一种或几种蛋白，叫做翻转酶(flippase)蛋白，可以催化磷脂的翻转过程。这种翻转过程的半衰期(half-time)，即一半新合成的磷脂移动到内质网的非胞浆侧所需要的时间，只有几分钟。红细胞膜含有少量的、不同种类的翻转酶，可以催化磷脂从膜一侧向另一侧翻转phospholipidflippase磷脂翻转酶的检验磷脂—二丁基磷脂酰胆碱是水溶性的，因为它含有短的、四碳脂肪酸链。当向纯磷脂囊泡悬浮液中添加这种磷脂时，这些磷脂会自发插入到囊泡的外层，但由于脂质体中缺少翻转酶，这些磷脂无法翻转到内层。实验证明，当加入一种翻转酶之后，添加在囊泡外侧的二丁基磷脂酰胆碱就可以翻转到膜内层。在膜内层，这种磷脂就可自发的运动到囊泡腔中。磷脂—二丁基磷脂酰胆碱(Dibutyrylphosphatidylcholine)特定的膜蛋白使磷脂在膜两侧平衡

膜的两侧常含有不同的磷脂组成。这种脂类分布的不对称性是如何达到的，目前还不清楚！其产生也可能部分受到磷脂对翻转酶蛋白的不同亲和性，或者整合膜蛋白在膜两侧特定区域的不均衡分布的影响。膜脂的运输胞内和胞间的囊泡运输磷脂交换蛋白的参与膜脂的运输胞内和胞间的囊泡运输细胞内转运囊泡(vesicleshuttle)从内质网膜上出芽、离开，并与高尔基复合体的膜融合；然后另一种囊泡再从高尔基复合体出芽，与其它的细胞器融合。这种反复的出芽-融合就完成了磷脂的转运。各种磷脂可以选择性的插入不同的转运囊泡，因此不同的细胞器有不同的磷脂组成。在动物细胞中，糖脂末端的糖链如半乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)的添加是在高尔基复合体中进行的。因此这种新合成的糖脂只存在于高尔基体膜的非胞浆侧(内腔侧)。合成后，糖脂经过转运囊泡—可能与运送新合成的分泌蛋白和膜整合蛋白相同的囊泡--运送到细胞膜上。Theendosomaloriginofexosomes–一种胞间囊泡运输－

NatureReviews4(2001)213

C)Argosomes.GPIanchoredgreenfluorescentprotein(GFP)–GPI(greenstar,redtag)intheouter-membraneleafletandgeranylgeranyl-anchoredcyanfluorescentprotein(CFP)–Rho(geranylgeranyl,blue)intheinnerleafletareincorporatedintotheargosomemembrane(orange),whereasmyristoylanchoredGFP(GFP–Myr)intheinnerleafletofthemembraneisnot.Da)Theexosomaloriginofargosomes.Inthedonorcells,argosomalmembraneisendocytosed(1)andtargetedtoendosomes(2);invaginationofargosomalmembraneintheendosomesgivesrisetomultivesicularbodies(MVBs)(3).TheoutermembraneofMVBsfusestotheplasmamembrane(4),whichreleasestheinternalvesicles,exosomesorargosomes(5).Exosomesfusewiththeplasmamembrane(6)ortheyare