PCR技术的应用课件

PCR技术的应用分子克隆操作的一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。二、PCR基本原理

DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。

PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中必需成分是

1.模板DNA2.DNA聚合酶

3.四种脱氧核糖核酸

4.正向和反向两条引物

5.适当的缓冲体系。模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒；模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等；每个反应中模板的量为1ng～1μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。1、模板DNA引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。2、引物它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18bp。5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物4、脱氧核糖核酸四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链温度。5、缓冲液变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是TaqDNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。三、PCR基本步骤下面为一个典型的PCR循环参数设置：备注：*比两条引物的Tm值低5~10℃。94℃5min94℃30sX℃*30s72℃1kb/min72℃5min25-35个循环四、影响PCR因素

虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。引物变性温度和时间退火温度和时间延伸温度和时间循环次数引物决定了PCR产物的长度和特异性。引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。1、引物退火温度与引物的Tm值相关，一般比Tm值低5~10℃。退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低PCR效率。在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为30s基本上就足够了。3、退火温度和时间Tm值的计算一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的最佳温度为70～80度，所以延伸温度设为72℃即可。在实践中TaqDNA聚合酶的延伸效率约为500bp/30s，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。4、延伸温度和时间在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，PCR产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。循环次数设为25~30次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。5、循环次数引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素一般原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200)。而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个。较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%常用的引物设计软件Oligo6（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowOligo6.44使用说明主要功能：专门的引物设计软件Oligo6.44启动界面Opensequencefile3个弹出窗口Meltingtemperature∆GInternalStabilityFrq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用Oligo设计引物时的3个标准Tm值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq曲线宜选用3’端Frq值相对较低的片段。ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性；第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好；第三项检查为GC含量，以45-55％为宜；第四项Falsepriming检查。引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo6.44SearchprimerOnlineprimer3service

凝胶准备①称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml1×TAE；②微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB5μl，并轻轻混匀。胶床准备①将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；②将胶床放在调整好的水平台上；铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5mm；室温下静置30分钟左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；六、PCR产物电泳鉴定向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10μl盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；电泳条件：电压80v；时间20～25分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶；电泳结果分析：①紫外检测仪直接观察电泳条带②摄影记录琼脂糖凝胶电泳预期结果：500bp560bpPCR产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物后测序。

PCR产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，利用连接酶将PCR产物连接到载体如pGEM-T后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。美国应用生物系统公司3130基因分析仪

24小时无人监控操作仪器设置更方便更简单新型自动灌胶系统进行灌胶检测池加热器改进了温度控制通过96孔和384孔板自动进样多色荧光检测七、PCR产物测序鉴定观看测序结果的软件Chromas软件运行界面打开一个测序结果峰型排列良好，无高大杂峰，说明测序结果可靠将测序结果输出为文本文件虽然现在的PCR技术使PCR扩增有很高的真实性，即PCR产物与模板DNA的一致性很高，但由于PCR扩增毕竟是在试管内进行的DNA复制，没有类似细胞内DNA错配修复机制，所以，在PCR产物扩增以后，仍要分析其与模板DNA的是否完全一致。最好的方法是将PCR产物测序，将测序结果与数据库作序列比对分析。八、目的基因序列变异分析

核酸序列比对

BLAST分析界面输入测序结果结果界面之一结果界面之二九、PCR污染的产生及防治

PCR污染的监测

PCR强大扩增能力+检测的敏感性经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题

NTC(NoTemplateControl):

必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。

常见的PCRcontamination常规PCR荧光定量PCRNTC432176598NTC引起PCR污染的原因模板间交叉污染容器被污染模板放置时,由于密封不严溢于容器外容器外粘有模板而造成相互间交叉污染模板吸取过程中,因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染引起PCR污染的原因PCR试剂污染PCR试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。引起PCR污染的原因PCR产物污染-最主要最常见PCR产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCRmixPCR产物的气溶胶污染：一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。

空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶引起PCR污染的原因实验室中克隆质粒的污染克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,其污染可能性也很大防止PCR污染首要原则永远要设置NTC对照如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信准备PCR的移液器要专用

千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR体系防止PCR污染空间：合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。理想状态：各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。防止PCR污染操作一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。选择质量好的Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气。打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。实验结束后及时清理台面。防止PCR污染移液器操作由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。1）准备PCR的移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头出现污染后解决办法更换试剂更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等

1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。

2）或者用10%漂白粉溶液擦拭

3)紫外光照射，照射距离应不超过90cm，照射时间最好过夜。实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法十、ColonyPCRCloningCloningisthewayinwhichwecantakeasinglemolecule,andmakelotsofbacterialcellsthatcontainanidenticalmolecule.Thesecellsareclones,hencethenameThisusedtobetheonlywaytoamplifyDNA.Itisstillbyfarthemostaccurate.ImperfectscienceMostoftheplasmid/insertcombinationswillnotligateMostofthebacteriawillnotbetransformedWeonlyneedonemoleculetogetintoonebacteriumtomakeonecolonyPCRfromclonesOftencloneswillreligatecontaininganyoldDNA(egprimerdimers)..TheDNAcangoinineitherorientationWecanusethePCRtotellwhichcolonieshavetheinsertwewant,andwhichorientationitisin.Site-mutationPCRPrimerDesignGuidelinesBothmutagenicprimersmustcontainthedesiredmutationandannealtothesamesequenceonoppositestrandsofthe