蛋白质公开课课件

第三章蛋白质第一节

蛋白质概论一、

蛋白质的化学组成与分类1、

元素组成碳50%氢7%氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮×6.252、

氨基酸组成蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子3、

分类（1）

按组成：简单蛋白：结合蛋白：详细分类，P75表3-1，表3-2。（注意辅基的组成）。（2）、按分子外形的对称程度：球状蛋白质纤维状蛋白质、膜蛋白质（3）、按功能分：酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。二、

蛋白质的大小与形状少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。蛋白质分子量=aa数目*110三、

蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。

一级结构：氨基酸顺序二级结构：α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲三级结构：α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段四级结构：多亚基聚集四、

蛋白质功能的多样性1．

酶2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）5．细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6．激素功能（胰岛素）7．（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）第二节

氨基酸一、

蛋白质的水解（详见P79）酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基碱水解：消旋，色氨酸稳定酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱二、

氨基酸的功能：（1）、组成蛋白质（2）、一些aa及其衍生物充当化学信号分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质，甲状腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素（3）、氨基酸是许多含N分子的前体物核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa（4）、一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物，（一）

编码的蛋白质氨基酸（20种）结构通式：1、按照R基的化学结构分类（1）、R为脂肪烃基的氨基酸（5种）R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.0±0.03）Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性从Gly至Ile，R基团疏水性增加Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理条件下不解离，，但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。

Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。★Cys的R中含巯基（-SH），具有两个重要性质：（1）在较高pH值条件，巯基离解。（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。

u

Cys与结石★Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。（3）、

R中含有酰胺基团（2种）酰胺基中氨基易发生氨基转移反应（4）、

R中含有酸性基团（2种）Asp、GluAsp侧链羧基pKa为3.86，Glu侧链羧基pKa为4.25它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个

氨基酸Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），侧链的氨基反应活性增大。Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用在280nm处，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱。（6）、

芳香族氨基酸（7）、杂环族氨基酸（1种）2、按照R基的极性性质可以分为4类：侧链极性(疏水性程度)Gly0Ser-0.3Glu-2.5Lys-3.0Ala0.5Asn-0.2Asp-2.5Arg-3.0Met1.3Gln-0.2

His0.5Pro1.4Thr0.4

Val1.5Cys1.0

Leu1.8Tyr2.3

Ile1.8

Phe2.5

Trp3.4

（1）、

非极性氨基酸9种在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心）。（2）、

不带电何的极性氨基酸6种这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水（3）、带负电荷的aa(酸性aa)（4）、带正电何的aa(碱性aa)胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys（二）

非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。（1）4-羟脯氨酸

（2）5-羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。

（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）

(4)г-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。

（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素（甲状腺蛋白中）（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。（三）

非蛋白质氨基酸P85不组成蛋白质，但有生理功能（1）L-型α–氨基酸的衍生物L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。三、

氨基酸的构型、旋光性和光吸收1、

氨基酸的构型与旋光性Gly一种构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）。

★氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。

P87表3-6蛋白质中L型氨基酸的比旋光度

★外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸组成消旋物★内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物2、

氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm近紫外区有吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

Lambert-Beer：在280nm有最大光吸收四、

氨基酸的酸碱性质（重点）1、

氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在

①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。②不溶于非极性溶剂→极性分子③介电常数高→水溶液中的氨基酸是极性分子。α-羧基pK1在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，当pH<8.0时，α-氨基以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷。2、

氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线HA→A-+H+

pH=pKa/+Log[A-]／[HA]（1）pKa/就是HA50%解离（[碱]=[酸]）时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+]（2）当HA50%解离时，溶液的pH值等于pKa/（3）pH=pKa/时，[碱]=[酸]（50%解离）pH>pKa/时，[碱]>[酸]（＞50%解离）pH<pKa/时，[酸]>[碱]（＜50%解离）Ka/Ka/=[H+][A-]/[HA]在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。

起点：100%Gly+净电荷：+1第一拐点：50%Gly+，50%Gly±平均净电荷：+0.5pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐点：100%Gly±净电荷：0等电点pI第三拐点：50%Gly±，50%Gly-平均净电荷：-0.5pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6终点：100%Gly-净电荷：-1Gly的等电点：★pH>pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。

pH=pI时，氨基酸净电荷为零pH<pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-NH3+，向负极移动。

问题：（1）pH=pKa/时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？（2）pI的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例（3）不同pH下的电泳行为和各组分比例

（4）利用pI和pKa/确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围（5）绘制滴定曲线（Glu）

根据P92页表3-7中Glu的数据（pK1α-COOH2.19，pK2α-N+H39.67，pKRR-COOH4.25，pI3.22）①绘出滴定曲线②指出Glu-和Glu=各一半时的pH值③指出Glu总是带正电荷的pH范围④指出Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围①解：见图②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67③pH<3.22时Glu总带正电荷④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25左右五、

氨基酸的化学性质（一）

α-NH2参加的反应1、与亚硝酸反应P136VanSlyke法测定氨基酸2、

酰化反应苄氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl)叔丁氧甲酰氯对-甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。★丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。NGly—Ala—Ser—Leu—PheC→→DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激发后发黄色荧光。3、

烷基化反应α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。★Sanger反应

2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸★Edman反应苯异硫氰酸酯，PITC

苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸4、生成西佛碱的反应（Schiff）西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。5、脱氨基反应（二）

α-羧基参加的反应①成盐、成酯反应P138

②成酰氯的反应P138氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。

3、叠氮反应P138活化羧基，可用于肽的人工合成4、脱羧基反应P138 Glu脱羧形成γ-氨基丁酸（三）

α-NH2和α-COOH共同参加的反应1、

与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（λmax=570nm）。Pro、Hy-Pro与直接形成黄色化合物（λmax=440nm）2、成肽反应（四）

侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰（一）基于电荷性质差异的分离方法六、

氨基酸的分离和分析1、

电泳分离

电泳的基本原理

Glu、Leu、His、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度：GluLeuHisLyspI3.225.987.599.74

2、

离子交换柱层析P152磺酸型阳离子交换树脂氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法——分配层析1、纸层析P151★在流动相中分配系数越大，移动越快。固定相：吸附水流动相：丁醇、醋酸、水分配系数★基本步骤：点样、展层、现色、定性（定量）2、薄层层析P152★支持剂：纤维素粉、硅胶、氧化铝粉★基本步骤：铺板、点样、展层、现色、定性（定量）3、分配柱层析支持剂：纤维素、淀粉、硅胶固定相：吸附水流动相；苯酚、正丁醇固定相：涂有薄层液体的惰性颗粒流动相：H2、N2、CO2★前提：样品能汽化、热稳定（三）气液层析（气相层析、气相色谱）P154分配层析、离子交换层析吸附层析凝胶过滤层析（四）高效液相层析（HPLC）P154第三节

蛋白质的一级结构

（共价结构）一、

蛋白质结构层次一级结构（共价结构）：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)二级结构：多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。三级结构：整条多肽链或亚基通过盘旋、折叠，形成紧密的、借各种次级键维持的球状构象。四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。二、

肽和肽键的结构肽：一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），肽单位：酰胺平面，肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链P1115肽

名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸写法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeu或ＳＧＹＡＬ，★肽键的结构特点：（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个Cα几乎处在同一平面内（酰氨平面）。（4）肽键亚氨基在pH014内不解离。（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成P112图3-30Pro形成的肽链三、

肽的重要性质1、

旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2、

肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。pH优势离子的净电荷：<3.5+23.5-4.5+14.5-7.807.8-10.2-1>10.2-2等电点：Pi=（4.5+7.8）/2=6.15问题1：求出二肽Lys—Lys及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。

问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?还是等于6.0？（小于6.0）3、

肽的化学反应肽的α-羧基，α-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。★双缩脲反应凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。四、

天然存在的活性肽1、

谷胱甘肽Glu—Cys—Gly红细胞中的巯基缓冲剂。参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。

2GSHGS—SG

H2O2+2GSH2H2O+GS—SG2、

短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。

L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val3、

脑啡肽（5肽）Met脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—MetLeu脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu具有镇痛作用。

生物体内寡肽的来源：①合成蛋白质的剪切、修饰②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、③动物肠道可吸收寡肽4、肽类激素★噬菌体表面展示技术与随机多肽库的应用：靶功能筛选多肽药物研究大分子之间的相互作用五、蛋白质一级结构测定

（一）

蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。1、

直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法NCA法裂解A1

A2

A3

A4

B法裂解B1

B2

B3

B4

2、

间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）（二）

蛋白质测序的一般步骤P168（1）

测定蛋白质分子中多肽链的数目（2）

拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）

断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。

（5）

测定多肽链的氨基酸组成。（6）

多肽链部分裂解成肽段。（7）

测定各个肽段的氨基酸顺序（8）

确定肽段在多肽链中的顺序。（9）

确定多肽链中二硫键的位置。（三）

测序前的准备工作1、

蛋白质的纯度鉴定纯度97%以上，均一。⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸2、测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数 SDS凝胶过滤法沉降系数法3、

确定亚基种类及数目

根据分子量和N末端数SDS4、拆分多肽链，并分别分离纯化⑴非共价键结合：8mol/L尿素，SDS⑵二硫键结合：过甲酸氧化：—S—S—+HCOOOH→SO3Hβ巯基乙醇还原5、

测定氨基酸组成酸水解的同时辅以碱水解。确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。6、

端基分析①N端分析★DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。

★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等

★PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。②C端分析★肼解法无水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。★羧肽酶法（Pro不能测）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysNH2N……………Val—Ser—GlyC图P118羧肽酶法测C末端（四）

肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1、

化学裂解法

①溴化氰—Met—X—产率85%②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—④羟胺NH2OH—Asn—Gly—约150个氨基酸出现一次2、

酶法裂解①胰蛋白酶LysX(X≠Pro)Arg——X

②胰凝乳蛋白酶Tyr——X(X≠Pro)Trp——X

Phe——X胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)③Glu蛋白酶Glu——X（Vs蛋白酶）④Arg蛋白酶Arg——X⑤Lys蛋白酶X——Lys⑥Pro蛋白酶Pro——X3、

肽段的分离纯化①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离③反相ＨＰＬＣ法根据肽段的极性分离④凝胶过滤要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带ＨＰＬＣ单峰Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－cl法）（五）

肽段序列测定及肽链的拼接1、

Edman法（1）耦联

PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-D（2）裂解无水三氟乙酸（TFA）ATZ—A+H2N—B-C-D（3）转化PTH—A

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）

2、

DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。

3、

有色Edman法荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’异硫氰酸酯。4、

用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法。1967液相测序仪自旋反应器，适于大肽段。1971固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。1981气相测序仪用Polybrene反应器。（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol20-40肽97%气相：5pmol60肽98%6、

肽段拼接成肽链16肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWTＢ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS（六）二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定1、

二硫键的确定（对角线电泳法）碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。2、

酰胺的确定Asp–Asn、Glu-Gln酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。3、

糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷-0-糖苷脂类：Ser、Thr、Cys磷酸：Ser、Thr、His经验性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)六、

蛋白质的一级结构与生物功能（一）

蛋白质的一级结构决定高级结构和功能

★牛胰RNase变性一复性实验：124个a.a残基4个链内二硫键。

分子量：12600

(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。（二）

同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。同源蛋白质的特点：①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。③多肽链长度相同或相近通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。1、

细胞色素CP182

分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩0人与猴1人与狗10人与酵母442、胰岛素●有24个氨基酸残基位置始终不变：A．B链上6个Cys不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。●其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。●猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。（三）

蛋白质一级结构的突变—分子病分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val

正常人血红蛋白，β.NGlu6镰刀型贫血β.NVal6生理条件下电荷：Glu-Va10

亲水疏水（四）

一级结构的部分切除与蛋白质的激活1、

血液凝固的机理凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原凝血酶

纤维蛋白原A纤维蛋白B

凝胶（1）、

凝血酶原P133图3-43在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324断裂，释放出48个a.a，产生活性凝血酶。A链49a.aB链259a.a（2）、

纤维蛋白原

P133图3-44α2β2r2

从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。

A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。

在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。P134上2、

胰岛素原的激活P134图3-45

※前胰岛素原，含信号肽。※胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。※活性胰岛素，高尔基体，切除C肽。七、

多肽与蛋白质的人工合成P193氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、苄氧酰氯（CBZ-Cl）、对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）羧基活化：酰氯法（PCL5）、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法。缩合剂：DCCI（二环己基碳二亚胺）直接接肽★多肽的固相合成支持介质：聚苯乙烯树脂

合成方向：C端→N端。合成程序：挂接→去保护→中和→缩合→断裂与去保护第四节

蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质一、

多肽主链折叠的空间限制从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转1、

肽链的二面角★只有α碳原子连接的两个键（Cα—N和Cα-C）是单键，能自由旋转。

★环绕Cα—N键旋转的角度为Φ环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ★当Φ(Ψ)旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ)=0°

★从Cα沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ(Ψ)角为正值，反之为负值。

2、

拉氏构象图：可允许的Φ和Ψ值Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和ΨP206表5-3蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。◆拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。对非Gly氨基酸残基，一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％二、

二级结构的基本类型1、

α螺旋（1）、

α螺旋的一般特征：★多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，★相邻的螺圈之间形成链内氢键★构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。典型的α螺旋有如下特征：①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一种右手螺旋②每圈螺旋：3.6个a.a残基，高度：0.54nm③每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm④氨基酸残基侧链向外⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。⑥肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基13表示氢键封闭的环包括13个原子。

封闭环原子数=3n+4（n=1、2、）（n：后边第n个aa）2.27螺旋（n=1）310螺旋（n=2）613螺旋（n=3）4.316螺旋（n=4）2.273103.6134.316n=1n=2n=3n=4（2）、

R侧链对α—螺旋的影响①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中连续存在时，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。（3）、

pH对α—螺旋的影响（4）、

右手α-螺旋与左手α-螺旋右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。（5）、

α-螺旋结构的旋光性α-螺旋结构是一种不对称的分子结构：（1）α碳原子的不对称性，（2）构象本身的不对称性。天然α—螺旋能引起偏振光右旋α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。2、

β-折叠

两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。（1）氢键与肽链的长轴接近垂直。（2）多肽主链呈锯齿状折叠构象（3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同反平β-折叠比平行的更稳定3、

β-转角（β-turn）也称β-回折（reverseturn）、β-弯曲（β-bend）球状蛋白质分子中出现的180°回折，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。

β转角的特征：①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。②主链骨架以180°返回折叠。③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键④C1α与C4α之间距离小于0.7nm⑤多数由亲水氨基酸残基组成。5、

无规卷曲

没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。三、

超二级结构由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。1、

复绕α-螺旋（αα结构）由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。2、

βxβ结构两段平行式的β-折叠通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。①βcβx为无规卷曲②βαβx为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。3、

β曲折（β-meander）由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。

4、

回形拓扑结构（希腊钥匙）5、

β-折叠桶由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。6、

α-螺旋-β转角-α-螺旋两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构四、

纤维状蛋白质含大量的α-螺旋，β-折叠片，整个分子呈纤维状广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。1、

角蛋白源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）。α-角蛋白，β角蛋白。（1）、

α-角蛋白（毛发）主要由α-螺旋结构组成三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微。

（2）、

β-角蛋白（丝心蛋白）以β-折叠结构为主。片层结构：反平行式β-折叠片以平行的方式堆积。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。2、

胶原蛋白3、

弹性蛋白4、

肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白第六节

结构域、三级结构

与球状蛋白质一、

结构域domain，motif(模块)在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。结构域一般有１００－２００氨基酸残基。结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口★EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构★锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn★亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，二、

三级结构：●整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。●三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。1、

三级结构有以下特点：许多在一级结构上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，2、

维持三级结构的作用力：（1）氢键（2）范德华力（分子间及基团间作用力）：定向效应：极性基团间诱导效应：极性与非极性基团间分散效应：非极性基团间（3）疏水相互作用（4）离子键（盐键）（5）共价健，主要的是二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。四、球状蛋白质三维结构特征P2281、含有丰富的二级结构元件2、具有明显的折叠层次3、分子呈现球状或椭球状4、疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在外表5、表面常常有空穴，配体结合部位（活性中心）第六节、亚基缔合与四级结构

P242一、有关四级结构的一些概念1、亚基与单体2、单体蛋白质3、原体（protomer)☆有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。有时也把原体称为单体。二、四级结构缔合的驱动力疏水作用极性基团之间的氢键和离子键二硫桥三、亚基之间的缔合方式1、同多聚与杂多聚（homomultimericandheteromultimeric)2、同种缔合与异种缔合（isologusandheterologus)同种缔合：亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的P244异种缔合：亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。四、四级缔合在结构和功能上的优越性1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3、提高基因编码的效率和经济性。4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6、适当降低溶液渗透压。7、具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节五、

寡聚蛋白与别构效应★别构蛋白：除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。★别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。★同促效应（同位效应）：一种配体的的结合对于其它部位结合同种配体的能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成`是对同位效应的一种修饰★异促效应（异位效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。★正协同效性：一种配基的结合促进后续配基的结合，S型配体结合曲线。★负协同效性：一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。★正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。★负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。第七节蛋白质结构与功能的关系一、

肌红蛋白的结构与功能：1、

肌红蛋白的三级结构哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。球状分子，单结构域。

8段直的α-螺旋组成，分别命名为A、B、C…H，拐弯处是由1~8个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。4个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。

血红素辅基，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。

p2552、

肌红蛋白的氧合曲线解离平衡常数：氧饱和度：Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K=P50=2torr解离常数K也称为P50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。3、

Hill曲线和Hill系数

P257图6-7Hill曲线Log[Y/(1-Y)]=0时的斜率称Hill系数（nH)表示配体结合部位之间在结合配体时的同促效应。肌红蛋白的nH=1二

血红蛋白的结构与功能在血液中结合并转运O21、

血红蛋白的结构：成人：HbA：α2β298%，HbA2：α2δ22%胎儿：HbFα2γ2早期胚胎：α2ε2▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似，2、血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线血红蛋白P50=26torr，肺泡氧压：Po2=100torr，Y=0.97

肌肉毛细血管：Po2=20torr，Y=0.25释放氧：△Y=0.97—0.25=0.72肌红蛋白（无协同效应）：△Y不足0.1协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。nH=1,无协同性nH＞1,正协同性nH＜1,负协同性3、

波耳效应及其生理意义血红蛋白上有CO2和BPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2。波耳效应：增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+和CO2。

P264图6-17pH对血红蛋白氧合的影响4、

BPG的别构效应BPG是血红蛋白的负效应物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。

无BPG时，P50=1torr，BPG=4.5mM时，P50=26torrBPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPG升高。（2）血库储血时加入肌苷可BPG。★协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率三、

免疫球蛋白的结构与功能1、

抗原与抗体★抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。★抗原性包括免疫原性和抗原特异性。★免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。★抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。★抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。★抗原决定簇的作用：①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。②与相应抗体的Fab结合。★抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。★抗体具有两个特点：①高度特异性②多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。2、

抗原抗体反应★抗体是2价的，抗原是多价的。★抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。图

★抗原抗体反应的条件：①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键等）★基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法：酶联免疫吸附测定（ELASA）Western印迹(Westernblot)MOV:MCB4.0\IMMUNOBLOTING第八节

蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定一、

蛋白质的酸碱性质和等电点★等电点★等离子点：中性盐（Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）影响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为0时的等电点称等离子点★等电点测定溶解度法聚焦电泳法二、

蛋白质的大小与形状测分子量的方法：★化学组成法测定最低分子量★SDS法★凝胶过滤法★渗透压法★扩散系数法★沉降系数法和沉降平衡法1.根据分子组成测定最小分子量如肌红蛋白含0.335%的铁Fe分子量55.8最小M＝Fe(%)=0.335=16700

(实为16900马心)牛血清白蛋白含Trp0.58%最低M=35200，实际为69000，含2个Trp*1002、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量p297-2983.据pr的渗透压p292用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：C：浓度（克/升）R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温度）T：绝对温度（开氏温度）：以大气压表示的渗透压4.SDS—PAGE（十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳）三、

蛋白质的胶体性质与选择性沉淀p299蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）1、

稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①蛋白质表面极性基团形成的水化膜②非等电状态时，同种电荷的互相排斥。③质点大小在1-100nm，可以进行布郎运动2、

选择性沉淀蛋白质的方法P300①盐析法:大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）结成不溶性沉淀④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。⑤加热变性沉淀。⑥等电点沉淀法四、

蛋白质的变性理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失。（1）变性的因素：强酸和强碱；有机溶剂：破坏疏水作用；去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；还原性试剂：尿素、-硫基乙醇；盐浓度：盐析、盐溶；重金属离子：Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。温度；机械力：如搅拌和研磨中的气泡。（2）蛋白质变性后，往往出现下列现象：①生物活性丧失②硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。③溶解度降低、沉淀，粘度增加。（2）变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏（5）可逆变性与不可逆变性★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。五、蛋白质分离纯化的一般原则P300纯化的实质：增加制品(preparation)的纯度或比活性一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析1、前处理：①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机（waringblender)匀浆器（homogenizer)超声波处理（ultrasonication)植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）②差速离心法收集细胞的某一组分（differentialcentrifugation)P209表3-20在不同离心力下沉降的细胞组分③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级（roughfractionation)一般用选择性沉淀法。①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法④热处理选择性沉淀法⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法3、细分级（finefractionation)①透析除盐②sephdexG-25凝胶过滤除盐★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳★密度梯度离心4、浓缩与保存浓缩方法：保存方法：①晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。②冻干粉保存：③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。六、

分离纯化蛋白质的主要方法P301★根据蛋白质的溶解度分离★根据电荷差异分离★根据分子大小分离★根据配体特性异性分离（亲和层析）★选择性吸附分离（物理吸附）★根据疏水性的差异