放线菌杂交育种第二组

放线菌的简介放线菌形态结构放线菌的繁殖放线菌杂交概况和原理放线菌的杂交技术现在是1页\一共有28页\编辑于星期五放线菌简介细菌的一个大类群，为革兰氏阳性。多为腐生，少数为寄生。寄生型放线菌会引起放线菌病和诺卡氏病。是工业发酵产品的主要生产菌种来源，尤其是抗生素、四环素、土霉素、卡那霉素等都由放线菌产生现在是2页\一共有28页\编辑于星期五放线菌的形态结构放线菌菌体为单细胞，大多数由分枝发达的菌丝组成。根据放线菌菌丝的形态和功能分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种.现在是3页\一共有28页\编辑于星期五营养菌丝又称为初级菌丝体、一级菌丝体或基内菌丝，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物。营养菌丝一般无隔膜；直径0.2~0.8m；长度差别很大；短的小于100m，长的可达600m.有的产生色素：黄、橙、红、紫、蓝、绿、灰、褐、黑等，包括脂溶性和水溶性，脂溶性色素局限于菌丝，水溶性色素可在培养基中扩散。现在是4页\一共有28页\编辑于星期五气生菌丝又称为二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。现在是5页\一共有28页\编辑于星期五

孢子丝当气生菌丝发育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌丝即为孢子丝，又名产孢丝或繁殖菌丝。

现在是6页\一共有28页\编辑于星期五

放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可利用菌丝片断进行繁殖。放线菌生长到一定阶段，一部分菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。孢子呈白、黄、绿、淡紫、粉红、蓝、褐、灰等颜色。繁殖方式现在是7页\一共有28页\编辑于星期五放线菌杂交原理放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系。现在是8页\一共有28页\编辑于星期五混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核体。异核体：

在同一个细胞质里，存在两种遗传上不同的细胞核，在营养上互补。菌落表型是原养型。基因型分别与亲本之一相同，无重组体出现。没有发生遗传信息交换。

（1）异核现象现在是9页\一共有28页\编辑于星期五接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体转移或遗传信息交换。接合导致部分合子形成。

（2）接合现象现在是10页\一共有28页\编辑于星期五部分合子：

是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本都不完整现在是11页\一共有28页\编辑于星期五部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的染色体组，即：异核系。异核系的菌落很小，遗传类型各不相同。能在MM或SM上生长。但异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。（3）异核系的形成现在是12页\一共有28页\编辑于星期五异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系。但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。（4）重组体的形成现在是13页\一共有28页\编辑于星期五现在是14页\一共有28页\编辑于星期五放线菌的杂交过程（1）接合两个不同基因型的菌株通过接合，供体菌株的部分染色体转移到受体细胞中，形成局部结合子现在是15页\一共有28页\编辑于星期五（2）杂合系和重组体杂合系局部结合子形成后，在繁殖复制过程中，两个不同基因型染色体进行一次交换，产生杂合系，使交换后的染色体不是环状结构而是线状的，并且在染色体的末端具有串联的重复体。在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，产生不同基因型的重组杂合系。现在是16页\一共有28页\编辑于星期五（3）重组体杂合系或重组杂合系在以后的进一步繁殖复制过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换，才能形成不同类型的重组体。杂合系是形成重组体所必需的阶段。现在是17页\一共有28页\编辑于星期五放线菌杂交技术

常用放线菌杂交方法：混合培养法玻璃纸转移法平板杂交法现在是18页\一共有28页\编辑于星期五混合培养法两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即为重组体。现在是19页\一共有28页\编辑于星期五1．直接亲本是杂交配对菌株直接亲本要求具有营养缺陷型或抗性标记2．斜面混合培养取两个直接亲本新鲜培养的成熟孢子或菌丝，重叠接种到完全培养基上，在适当温度下培养，根据选育目的决定培养时间。3．单孢悬液的制备培养后长出一层孢子。待孢子成熟后，加入适量的含0.01%月桂酸钠的无菌水，轻轻刮下斜面孢子，转入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，摇动10min，过滤，制成分散的单孢子悬液。然后离心洗涤，沉淀的孢子加无菌水制成单孢子悬液。混合培养法具体方法现在是20页\一共有28页\编辑于星期五4．重组体的检出（1）原养型重组体的检出：（2）异养型重组体的检出：5．杂合系分析杂合系菌落的分离：重组体的鉴别：重组体获得后，其中把原养型重组体进一步按育种程序迸行研究。

混合孢子液选择培养基影印到基本培养基和选择培养基

混合孢子液基本培养基10-15d互养杂合体和回复突变原养性重组体现在是21页\一共有28页\编辑于星期五现在是22页\一共有28页\编辑于星期五玻璃纸杂交法原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链霉素的SM上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求得不到满足也不能在该SM上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该SM上生长。使用本法必须具备两个条件：第一，直接亲本必须带有两个遗传标记，即一个直接亲本带有一种营养要求和抗药性（如抗链霉素）；而另一个直接亲本则为对该药物敏感（如对链霉素敏感）和带有另一种营养缺陷型。现在是23页\一共有28页\编辑于星期五第二，选择性培养基是带有抗性药物的补充培养基。

该方法是在选择性培养基上挑选异核系菌落，其原理是：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含有链霉素的选择性培养基上不能生长。敏感性亲本和抗药性亲本因为营养要求得不到满足也不能在该选择性培养基上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该选择性培养基上生长、繁殖成为异核系菌丛。现在是24页\一共有28页\编辑于星期五玻璃纸法平板杂交的具体方法（1）在两个直接亲本的新鲜、成熟孢子斜面中加入无菌水，轻轻刮下孢子，制成孢子悬液。（2）混合液接种到覆盖在完全培养基平板上半透型的玻璃纸表面，置于适当温度培养24h。待玻璃纸表面布满一层基质菌丝而未长出气生菌丝，这时可终止培养。（3）用无菌镊子将玻璃纸以无菌操作转移到CM+链霉素琼脂平板上，室温下继续培养。（4）当基质菌丝停止生长，杂合系的气生菌丝在玻璃纸表面开始生长，可用微针挑取杂合系的菌丝丛，进一步分析，检出分离子。现在是25页\一共有28页\编辑于星期五分离子的检出与鉴别方法一：事先准备好MM平板，在其上滴一点含有0.01%月桂酸钠的无菌水，挑取杂合系菌丝丛于水滴中涂抹均匀，适温培养即可长出各种分离子。方法二:挑取杂合系菌丝丛，加入到盛有一定量无菌水的试管内，制备单孢子菌悬液，分离于完全培养基平板上，菌落形成后，用影印法复印到各种选择性培养平板上，可以鉴别出不同类型的重组分离子。现在是26页\一共有28页\编辑于星期五玻璃纸杂交法法优点玻璃纸杂交法不仅可以分离杂合系，而且可以分析杂合系。与混合培养法中的杂合系分析相比，玻璃纸杂交法较为简单，时程也短。玻璃纸杂交法可以在一定时间间隔中断