亚病毒感染因子

亚病毒感染因子第1页，共62页，2023年，2月20日，星期三非细胞生物朊病毒：只含蛋白质一种组分

prion亚病毒:Subvirus至少有核酸和蛋白质两种组分类病毒：只含具有单独侵染性的RNA组分viroid卫星病毒、卫星RNA：天生缺陷病毒,satellitevirus包括卫星RNA真病毒:Euvirus第2页，共62页，2023年，2月20日，星期三疯牛病(MadCowdisease)第3页，共62页，2023年，2月20日，星期三一、类病毒viroid1922年发现，减产20%-70%潜伏期长，提纯和电镜观察无病毒粒子瑞士学者T.O.Diener1971年发现马铃薯纺锤形块茎病的病原是一种只有侵染性小分子RNA而无蛋白质的感染因子，称为类病毒(viroid)——PSTV。类病毒经带毒叶片、种子以及媒介昆虫传播，可引起马铃薯、西红柿、苹果、柑桔、椰子等多种经济植物严重病害Potatospindletuberdisease,PSTD第4页，共62页，2023年，2月20日，星期三T.O.Diener几项研究试验

(1967-1971,用番茄研究)1、超离心：2、有机溶剂处理：3、酚处理：4、核酸酶处理：5、密度梯度离心：105000×g仅10%在沉淀中(去脂肪)沉降系数不变RNase处理，丧失活性(蛋白变性）侵染活性更高PSTV沉降系数7~10S第5页，共62页，2023年，2月20日，星期三定义类病毒是一个裸露的闭合环状RNA分子，它能感染寄主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症。类病毒的分子量小，仅为最小RNA病毒的十分之一，约10万Da类病毒是共价闭合的单链环状RNA分子，大小为246-399个核苷酸。所有的类病毒RNA没有mRNA活性，不编码任何蛋白第6页，共62页，2023年，2月20日，星期三马铃薯纺锤形块茎病类病毒Potatospindletuberviroid(PSTV)提纯后的PSTV在电镜下观察(脲展层)：长50nm的棒状dsRNA分子，由2个互补的半体组成，一个含179个核苷酸，另一个含180个核苷酸，两者间有70%的碱基以氢键方式结合，形成122个碱基对，整个棒状结构中有27个内环，最大的螺旋含8个碱基对，最大的内环含有12个核苷酸。第7页，共62页，2023年，2月20日，星期三PSTV的结构第8页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒的分类目前ICTV公布的类病毒有27种，分为2个科、7个属：1、马铃薯纺锤形块茎类病毒科5属2、鳄梨白斑类病毒科2属第9页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒病诊断和鉴定Koch’spostulates1、在病体中找不到细胞和体细胞的致病因子，可机械摩擦或昆虫媒介传染2、检测小分子核酸5S~7S,区别于植物的RNA

PAGE浓度5%、10%、20%

(一般病毒2%）3、接种电泳带酚抽提液接种敏感寄主4、提纯第10页，共62页，2023年，2月20日，星期三生产实际诊断的几种方法1、指示植物2、凝胶电泳（应用广，但手续复杂）3、互补DNA（精确，适用）

分子杂交，有已知类病毒RNA第11页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒的提纯

酚相（去掉）

样品上清（去掉）酚相（去掉）水相沉淀离心水相离心上清

沉淀上清(去)

沉淀(类病毒)(RNA)乙醇(各种RNA)DNaseSDS酚LiCl大分子RNAbuffer酚、SDS冷乙醇破坏寄主DNA去酶蛋白第12页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒致病性机理类病毒RNA分子直接干扰寄主细胞的核酸代谢类病毒也能结合到前mRNA的识别位点上，干扰mRNA的加工类病毒的+RNA和-RNA还能作为寄主基因组DNA模板的竞争者，与依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ结合，使之指导类病毒的复制，破坏了mRNA的合成。第13页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒复制类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶健康植物中含两种类型的RNA合成系统：1、依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ2、依赖于RNA的RNA聚合酶类病毒RNA在分子内的高度碱基配对和G:C含量，使其非常象DNA分子，寄主的依赖于DNA的RNA聚合酶可能以其作模板合成类病毒的RNA第14页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒复制的滚环理论：+RNA-RNA寡聚物+RNA寡聚物裂解成+RNA单位长度的线状分子共价闭合环状分子类病毒前体末端修饰第15页，共62页，2023年，2月20日，星期三第16页，共62页，2023年，2月20日，星期三环状类病毒进入宿主细胞后：首先以(+)链类病毒为模板转录生成多个单位长度的(-)链复制中间体，其(-)链复制中间体有两种可能的命运：先被切割，再环化：(-)链复制中间体先被切割生成单位长度的线状(-)链分子，再自我环化，然后以环化(-)链为模板转录出多个单位长度的(+)链复制中间体，再进一步修饰和连接，形成具有感染性的单体环化的类病毒分子；先转录，再被切割修饰：多个单位长度的(-)链复制中间体直接转录生成(+)链复制中间体的模板，然后剪接修饰。鳄梨白斑类病毒ASBVd(+)链和(-)链复制中间体中均发现有锤头样核酶结构，因此推测ASBVd可能是采取第一种复制途径，而PSTVd可能是利用第二种复制途径。类病毒复制的滚环理论第17页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒的起源推测、设想：1、原始生命形态非生命—类病毒—病毒—原始细胞……2、起源于寄主核酸存在于细胞核，与寄主核酸同源性高3、起源于病毒核酸缺失编码外壳蛋白的基因，RNA噬菌体核酸复制第18页，共62页，2023年，2月20日，星期三类病毒病的防治1、综合防治

避病、防侵染、培育无病种苗、防治传播介体2、抗病品种3、药剂：微量元素ZnSO4、H3BO3、CuSO4等4、弱毒株保护第19页，共62页，2023年，2月20日，星期三二、朊病毒prion美国动物病毒学家Prusiner1982年研究羊的瘙痒病(Scrapie)病原（核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学因子处理）时发现的一种对人有侵染性的蛋白质颗粒，称为“Prion”(Proteininfection的缩写)或“Virion”，译为“朊病毒”，或“毒朊”。Prusiner1997年因此获诺贝尔生理和医学奖2004年Prusiner证明,将提纯的朊病毒注射到基因工程小鼠的脑中时，可以引起脑病，该项研究发表于2004年7月30日Science。第20页，共62页，2023年，2月20日，星期三二、朊病毒prion人和哺乳动物朊病毒病的潜伏期特别长．一般为数月乃至数10年时间，病程进行缓慢，由朊病毒感染中枢神经系统所产生的病理学特点为：①神经原、神经轴索、星状细胞、树枝细胞呈进行性空泡化②神经胶质增生；③细胞外淀粉样变性蛋白沉积，形成光镜下可见的病理学特征如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝(scrapic-associatedfibril，SAF)CJD则表现为淀粉样蛋白斑(amyloidplaque)，其实质均为传染性朊病毒蛋白的团块。第21页，共62页，2023年，2月20日，星期三第22页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒在电镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm(一般为125-150nm)，杆状颗粒不单独存在，总是呈丛状排列，其大小和形状不一，有的丛含有多达100个杆状颗粒。朊病毒蛋白(PrP)是由一种分子量为33-35kD的正常细胞蛋白prpc发生构型转变形成的，由于它类似于羊搔痒因子，故又称为prpsc。朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)第23页，共62页，2023年，2月20日，星期三prpsc是prpc的异构体，2者的一级结构和分子量大小完全相同。prpsc在蛋白酶解作用下切去N端序列，可生成prpsc27-30kD。prpsc

27-30kD是一种蛋白酶抗性蛋白(proteinase-resistantprotein)，该蛋白能够聚合成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白。正常的prpc与prpsc之间在构型上的差异主要表现为α螺旋含量减少，β折叠的含量增加。朊病毒蛋白(Prionprotein,PrP)第24页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒蛋白(Prionprotein,PrP)第25页，共62页，2023年，2月20日，星期三侵染性的朊病毒的单体含有3个或少于3个prp分子，而杆丛聚合体可能含多到105个prp分子，其半感染剂量(ID50)介于10-100个杆状体。朊病毒的分子量为27-30kDa。提纯的朊病毒用刚果红染色，在光学显微镜下可看到许多无定形结构，大小为1-20μm。Prp具两种形式prpc

和prpsc。来源于同一个基因，宿主染色体基因编码，人的prp基因定位于20号染色体的短臂上。朊病毒蛋白(Prionprotein,PrP)第26页，共62页，2023年，2月20日，星期三

prpc是一种细胞膜结合的糖蛋白，但通过膜内陷可进入细胞内，通常位于细胞内的prpc是可溶性蛋白。在神经系统中的可能作用：

参与神经系统功能的维持

通过抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤，PrPc通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性参与淋巴细胞的信号转导

参与核酸代谢

PrPC可能具有调整程序细胞死亡的功能PrPc的生理功能

第27页，共62页，2023年，2月20日，星期三PrP27~30是羊搔痒症致病因子证据1、核酸酶、蛋白酶、紫外线和其它化学因子处理2、用生化方法与搔痒因子共纯化，其浓度与传染力在正相关3、PrP27~30的分解动力学与传染性相同4、亲和层析纯化的PrP27~30具有传染性5、用中和抗体中和PrP27~30其传染性消失第28页，共62页，2023年，2月20日，星期三-+溶于非变性洗涤剂+-与特异的抗体反应不释放可从膜释放依赖GPI（糖基磷酸肌醇）附着细胞膜-(部分耐受)+蛋白酶消化prpscprpc性状Prp构型变化导致蛋白质性质变化prp功能：学习和长期记忆的保持所必须CJD、GSS痴呆——这些功能的丧失第29页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒蛋白的传染过程少量PrPSc与细胞PrPc结合后，以PrPSc为模板，使PrPc发生明显的构象改变而转变为PrPSc；PrPSc传染扩增，最后使PrPc全部转变成不溶性的PrPSc；脑组织形成淀粉样斑块直至死亡；PrPc转变成PrPSc后造成PrPc缺失，使得：神经细胞SOD酶活性下降，从而对超氧化物等所造成的氧化损伤的敏感性增加神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综合导致神经细胞死亡变性

第30页，共62页，2023年，2月20日，星期三PrPc分子（圆圈左侧）与PrPSc分子（圆圈右侧）相互作用，并转化为后者的循环过程。PrPSc分子通过形成长纤维（右）的方式破坏正常的脑组织（左）。2005/4/22《cell》传染过程PrPcPrPsc第31页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒蛋白质的构象转变假说1、“种子”模型

2、重折叠模式

1、“种子”模型

prpsc充当“种子”,prpc单体构象比prpsc更稳定在没有“种子”存在时，固有的PrPC和极少量PrPsc单体之间发生快速的可逆性构象变化。当条件适宜时，PrPsc分子之间可互补缔合而变得稳定。从而使平衡式向PrPsc方向反应，直至形成一稳定的“种子”。这个“种子”可通过互相粘着而继续生长，最后碎裂成小的感染单位。此模式能解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病。已有科学实验支持。2、重折叠模式模板介导的转换过程依靠催化PrPc或一个不稳定的中间体的重排来提高转换，以形成更稳定的PrPsc构象。能解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病。点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量，同时加快它转换成PrPsc的速率。但此模型还无科学实验支持。第32页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒研究进展科学家首次观察到朊病毒入侵脑细胞的活动

将标记后的prpsc加入到培养的神经细胞中观察并用共焦显微镜照相——利用激光来扫描荧光样品，并获得清晰的三维图像。绘制1000多张不同的图像并将获得的照片作成录像，显示出了prpsc进入细胞、沿着窄小的神经突前进并最终进入最接近的邻居细胞的过程

2005/5/25JournalofNeuroscience

朊病毒传染性与蛋白分子大小有关：

prpc以单分子状态存在，对机体没有任何危害。但变异prpsc会多个分子聚集在一起（14至28个蛋白分子），然后扭曲变形。变异的朊病毒颗粒，会吸引单分子状态存在的prpc并将其“同化”，最终使动物脑组织海绵化，产生许多孔洞。（2005/9/8Nature）第33页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒研究进展

淋巴结是传播朊病毒的关键淋巴结是传播少量朊病毒到神经系统的关键所在；不能排除：淋巴结和朊病毒在身体内向其它非神经组织传播有关。2007/9/25BMCVeterinaryResearch致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发现

有一种蛋白可能是朊病毒中关键蛋白，裂解感染性蛋白生成“种子”片段，然后侵袭脑组织致宿主迅速死亡。传播过程中还存在另一关键步骤——朊病毒复合物的裂解片段的存在。朊病毒复制需要有热休克蛋白(Hsp104)参与，可能具有这种蛋白“粉碎机”的功能。（2007PLoSBiology）第34页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒研究进展找到疯牛病致病新病毒

《欧洲分子生物学组织杂志》2007，10除了已知的被称为PrP的朊病毒蛋白外，新发现了另一种被称为‘沙杜’（Shadoo）的朊病毒蛋白。

“像疯牛病这样的朊病毒疾病，我们在许多方面都尚未搞清。比如正常的朊病毒蛋白有哪些功能，朊病毒如何在动物之间进行传播，以及如何导致脑细胞死亡等。希望新的沙杜朊病毒的发现，会在这些重要问题上给我们新的启迪。”第35页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒研究展望已经从结构水平上认识朊病毒：PrPC的结构、折叠动力学和可能转变成PrPsc的折叠途径。蛋白酶消化敏感性实验和脑组织杂交分析证明PrPsc可采取不同的构象。已经知道朊病毒有不同的株型且相互杂交。朊病毒传播和致病的必需区域已被限定为两个不同片段，共同区域只包含106个残基。随着X-射线衍射技术、核磁共振光谱等技术应用，朊病毒结构的研究即将取得成功，其功能学的研究已成为科研的工作重点。第36页，共62页，2023年，2月20日，星期三疯牛病(Madcowdisease)第37页，共62页，2023年，2月20日，星期三疯牛病(Madcowdisease)牛海绵状脑病BSE(BovineSpongiformEncephalopathy)一、来源与分布1985年英国农场牛群比利时、法国、德国、意大利、加拿大、日本等二、易感动物：小白鼠、羊、猪、猫、羚羊、金丝猴、猕猴等，但不感染仓鼠三、传播途径：垂直传播、被污染的饲料经口腔传染。常见的传染源：骨、肌肉、肉骨粉、脏器、淋巴结、唾液、血液等第38页，共62页，2023年，2月20日，星期三四、病原1986分离到“痒病相关原纤维”(Scrapie-associatedFibrils,SAF)，经氨基酸分析确认与“锯形蛋白Prp-Scrapie,PrPsc”有98%同源性1987，用BSE患牛脑组织匀浆接种小白鼠，症状相似分布于中枢神经系统，其次存在于脾、淋巴结，肠、唾液腺中浓度高，肌肉和血液中较低，粪便、尿液中很少对高强度理化灭活处理有很强抵抗力，经核辐射仍可存活，普通烹调温度、消毒、冷冻和干燥均无灭活作用，对强酸强碱抵抗力强，对福尔马林、紫外线不敏感，121℃耐30min，用2-5%次氯酸钠处理24h才灭活疯牛病(MadCowDisease)第39页，共62页，2023年，2月20日，星期三疯牛病(Madcowdisease)五、临床症状1、行为变化：恐惧、神经质、狂暴、具攻击性2、姿势和运动异常：后躯运动失调、站立困难、头部和肩部肌肉震颤抽搐、倒地不起3、感觉变化：对声音、气味和触摸过敏离群、不安、体温偏高、体质下降、产奶量减少、呼吸频率高、震颤、倒地不起、死亡发病几个星期——12个月潜伏期2—8年（4-5）牛：22个月——17岁（3-5年）第40页，共62页，2023年，2月20日，星期三疯牛病(Madcowdisease)六、病理变化1、脑灰质呈空泡变性2、神经元消失3、原胶质细胞肥大七、英国疯牛病风波1985年首次发现，1996/3/20（新型克-雅氏病）直接经济损失450亿美元，补偿农民120-180亿，社会问题（牛只存栏数1180万头，从业20万人，总产值60亿美元）、对英国政治、外交等影响大八、我国检疫政策牛只存栏数1.5亿头，年产牛肉600多万吨，牛奶700多万吨如……扑杀——1500亿元直接损失第41页，共62页，2023年，2月20日，星期三朊病毒消毒方法和朊病毒病的防治病原因子136℃高压蒸汽消毒1h1~2mol/LNaOH处理1h以上5mol/L以上的NaClO溶液消毒2h960ml/L的乙酸溶液浸泡1h以上（固定组织的甲醛100ml/L对病料消毒不彻底）焚烧病畜及产品培养抗病家畜

蛋白质构象变化的机理第42页，共62页，2023年，2月20日，星期三人的朊病毒病可分为传染型、遗传型和散发型三种形式传染型——朊病毒在人群中水平传播Kuru病:主要局限于巴布亚新几内亚的Fore族人群，传播途径与食人肉习俗有关,症状与羊搔痒病相似医原性CJD:通过接受CJD患者捐献的器官或静脉注射污染有朊病毒的人生长激素传播遗传型——家族性CJD、FFI和GSS，由生殖细胞突变形成散发型——大多数CJD和部分GSS，其致病机制可能与体细胞突变或PrP的自发性构型改变有关除此之外，在英国和法国还发现一种变异型CJD，可能是由牛朊病毒传染给人所引起的人类朊病毒病第43页，共62页，2023年，2月20日，星期三人类朊病毒病1、库鲁病（kuru)/震颤病2、克雅氏病（CJD)3、格斯综合症（GSS)4、新型克雅氏病（vCJD)5、传染性病毒痴呆病（早老性痴呆病）(PresenileDementia)6、致死性家族失眠病(FatalFamilialInsomnia,FFI)第44页，共62页，2023年，2月20日，星期三库鲁病（kuru)亚急性传染性海绵状脑病小脑共济失调、震颤——丧失运动能力，伴有构音障碍，患者100%死亡。潜伏期4~30年新几内亚东高原Fore人陋习——吃尸脑流行区有3万多人/1000英里2发病成年女:男5:1男:女2~3:1高原温度（水沸点）<95℃第45页，共62页，2023年，2月20日，星期三克雅氏病（CJD)全球分布，我国有发生(潜伏期可长达30年)感冒样症状——精神异常，痴呆、小脑共济失调、昏迷伴有肺部感染死亡病程：数月~1年（平均5个月）散发型90%、遗传型10%医源型少：污染的医疗器械、组织移植、注射脑垂体源激素（生长素、促性腺素等）100%死亡第46页，共62页，2023年，2月20日，星期三新型克雅氏病（vCJD)207例CJD中10人有明显不同临床：忧虑、抑郁、进行性神经异常——小脑综合症，健忘、痴呆肌阵挛或舞蹈病无CJD脑电图异常

病理：海绵状脑与BSE的关系：第47页，共62页，2023年，2月20日，星期三用于诊断朊病毒病的技术第48页，共62页，2023年，2月20日，星期三CJD-humanKuru-humanBSE-(cow)Scrapie-(sheep)第49页，共62页，2023年，2月20日，星期三三、卫星病毒satellites在植物病毒中，有些病毒含有两种相关的病毒颗粒:一种是较大的病毒颗粒，另一种是较小的病毒颗粒

这两种病毒颗粒之间的抗原性完全不同;它们的RNA核苷酸序列也无同源性;小病毒颗粒RNA的侵染与复制必需依赖于大病毒颗粒将这种小病毒颗粒称为卫星病毒，大病毒颗粒称为辅助病毒helpervirus。SatelliteTobacconecrosisvirus(STNV)16.8nm/28nm第50页，共62页，2023年，2月20日，星期三三、卫星病毒satellites丁型肝炎病毒HDV——HBV比较不同卫星病毒，发现它们都有下列性质：单独没有侵染性，必需依赖辅助病毒才能侵染和复制（基因组有缺陷）非辅助病毒复制所必需，可抑制辅助病毒的复制卫星病毒的RNA能够编码自身的外壳蛋白，其外壳蛋白与辅助病毒没有血清学关系卫星病毒RNA与辅助病毒基因组RNA核苷酸序列无同源性第51页，共62页，2023年，2月20日，星期三四、卫星核酸1976年美Kaper等在CMV中首先发现:卫星RNA是伴随病毒复制的低分子量（300~400b)线状小RNA，不能独立复制,完全依赖于特定辅助病毒,它与病毒RNA无序列同源性。CMV的卫星RNA：335个核苷酸组成，复制依赖于辅助病毒，但又干扰辅助病毒RNA的复制，降低病毒的致病能力，并改变寄主植物的症状表现。既是侵染病毒的RNA，又是亚病毒之一。卫星RNA能作为黄瓜花叶病毒病的生防因子第52页，共62页，2023年，2月20日，星期三ICTV已将卫星核酸分为：单链卫星DNA：番茄卷叶病毒卫星DNA双链卫星RNA：啤酒酵母M病毒卫星RNA单链卫星RNA：CMV卫星RNA等第53页，共62页，2023年，2月20日，星期三我国卫星核酸的研究：中科院微生物所田波研究员，1981年从应用角度，将其作为生防因子，研究中发现卫星RNA完全符合Koch’s法则，侵染特异的寄主（病毒），且能维持自身的遗传特性。提出卫星RNA属于亚病毒第54页，共62页，2023年，2月20日，星期三病毒卫星RNA致弱病毒机理一、抑制病毒及其基因组复制CMV为三分体RNA基因组病毒，含：RNA-1（3900b）RNA-2（3400b）侵染性所必须RNA-3（2193b）另含有亚基因组RNA-4(1027b)，其卫星RNA称RNA-5（335b）研究单独卫星RNA对病毒复制的影响（1）去除卫星RNA的CMV（电泳洗脱,多次单斑分离，纯化）（2）表达卫星RNA的转基因植株第55页，共62页，2023年，2月20日，星期三卫星RNA弱CMV强CMVA492(单抗ELISA检测)

+++0.24~0.27(31.5%)

-++0.38~0.42(49.4%)--+0.77~0.85转卫星基因和未转化（对照）的烟草和番茄幼苗接种不含卫星RNA的CMV后(用病汁液定量接种藜)：表达卫星