细胞培养在分子水平和细胞水平研究

新疆农业大学专业文献综述题目:姓名:郑峰学院:食品科学与药学学院专业:食品科学班级:13级研究生学号:1340020279成绩：指导教师:武运教授2014年2月20日细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展摘要：利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品，为提高细胞活力和细胞生长密度，采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞，选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器，在线监控细胞生存环境和生理活动，减少培养过程中培养基的抑制因素，从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因，可减缓细胞凋亡的发生，提高细胞活性和蛋白产量，本文从分子水平和细胞水平两方面进行综述。关键词：动物细胞;培养环境;DNA;微载体Researchadvanceinlarge-scalecultureofanimalcellsatthelevelofMoleculeandSingleCellAbstract:Manybiologicalproductsweremanufacturedbymeansoflarge-scalecultureofanimalcells.Toincreasecell-specificproductivityandcelldensity,serum-freemediasupplementedwithseveralnutrimentswereusedforcellculture,andmicrocarrierswerechoseninfavorofcellgrowthandhighcelldensity.Bioreactorswithsimplemanipulation,goodqualificationandaerationwereadopted.Moresuitableconditionsforcellgrowthcouldbegiventhroughon-linesupervisingtheenvironmentforcellgrowthandrestraintfactorsincellculturing.Furthermore,theanti-apoptosisgenesusingrecombinantDNAtechnologycanincreasecellviabilityandproductivity.Porousmicrocarrierswasemphasizedinlarge-scalecultureofanimalcells.Keywords:animalcell;cultureenvironment;DNA;microcarrier组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来。近一个世纪以来，从能维持组织存活到生长出新细胞，从少数组织到各种组织细胞的培养，从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺，组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一。目前，动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。在动物细胞大规模培养的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的影响，维持细胞高存活力和高效表达。若以生产蛋白为目的的体外细胞培养，同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化。1基本概念[1-2]细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养(PrimaryCulture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养(Subculture)。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系(Cellline)或细胞株(CellStrain)。这些细胞一般可顺利传40~50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类为有限细胞系/株；在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。2体外培养动物细胞的生物学特性动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染；对生长环境和培养环境要求苛刻[3]。2.1细胞生命周期性变化[1]体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。2.1.1潜伏期(Latentphase)细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。2.1.2指数生长期(Logarithmicgrowthphase)指数生长期是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛。在接种细胞数量适宜的情况下，指数生长期持续3~5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，营养环境恶化，呈现接触抑制(Contactinhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制(Densityinhibition)。2.1.3稳定期(Stagnatephase)细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH值下降，细胞停止增殖，进入停滞期。营养环境继续恶化后，细胞受损直至死亡。2.1.4体内外细胞的差异细胞在体外培养后，失去了神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，失去原有组织结构和细胞形态，分化特性减弱或不明显，直至发展成恶性细胞[1-2]。3细胞培养环境及培养基的选择3.1培养基的选择培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。一般情况下，动物细胞的生长均有赖于血清的存在。但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[4]，给生物制品的生产造成了不便，这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[5]，尤其是中华仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等，其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽，CHO细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[6]。在人类细胞培养中，某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍。另外，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。应用无血清培养基培养动物细胞的成功，还将为某些痘苗的生产降低成本[7]。目前，大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基，从而避免了血清培养基污染的可能性，并减少了纯化的难度。但无血清培养基缺乏广泛的适应性，不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方。无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景，但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题。在培养基中加入某些化合物，如金精三羧酸(Aurintricarboxylicacid，ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等，在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[9]。但是，由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人，仍然存在病毒污染的危险，只有完全采用非动物来源的材料，才是相对安全的，而植物提取物将是理想的选择。可以这样预测，未来开发的新一代无血清培养基，将是一种既无血清、无蛋白，又可以高温消毒，且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[10]。3.2细胞培养环境和生长条件3.2.1无菌无毒环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞，由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，就可能会导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，应及时清除细胞代谢产物，以保持细胞生存环境无菌无毒。3.2.2恒温要维持培养的细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。偏离适当的温度范围，细胞会受到损伤，影响正常代谢甚至死亡。3.2.3气体环境气体是哺乳动物细胞培养所必需的条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环供给细胞能量和生长组分；二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞增殖所需成分，并对调节培养基pH值有重要作用。3.2.4缓冲环境该环境的作用是维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。4微载体的选择大多数被培养的动物细胞都是贴壁依赖性细胞，而传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶培养等方式获得，其操作繁复，且耗费空间及人力。1967年，VanWesel[11]首先提出了“微载体”培养系统，为贴壁依赖性细胞的高产培养出了一个新的概念。经过几十年的研究，现在微载体培养已广泛应用于动物细胞的培养，并取得了许多成果。如微载体的大小和电荷量达到了最优化，以提高细胞的生长能力；微载体表面特性的改善，以利于细胞的快速贴壁等。细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和培养基的不同而变化，因此为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要。近年来开始使用的多孔微载体[32]可提供大的表面积B体积和最大的细胞密度[12]，然而以该载体培养的有些细胞系却贴在微载体内，其“移动性”相对较差。因此需要研制一种更好的培养方式，以提高微孔的开放性或者改善其表面特性，从而在提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性。5维持细胞生长所需的最佳条件影响细胞培养的主要因素有CO2、DO、温度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等。一般来说，最适CO2水平为4%~10%，DO维持在20%~50%，温度一般为37℃，pH值在7。0~7。4之间。葡萄糖是细胞培养过程中的主要能量来源，必须维持在一定水平。氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素。氨离子抑制谷氨酰胺(Glutamine，G1n)的代谢途径，应限制Gln用量，并尽可能去除培养基中的氨;高浓度乳酸可抑制细胞生长，应降低培养基中的葡萄糖浓度以减少乳酸产生，在动物细胞大规模培养中常常需添加果糖，以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基，实际应用中降低甲基乙二醛的浓度主要也是通过降低葡萄糖用量来实现的[13]。6分子水平的研究例如，细菌（包含放线菌）基因组有5S、16S和23S三种rDNA.16SrDNA大小在1500bp左右，其所代表的信息量适中，是进行分类研究的理想靶位[14]。利用16SrDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16SrDNA把序列，并进行后续的DNA测序，与Genbank中已知序列进行同源性比较后判定细菌种类，可将细菌划分到属或种。真菌基因组中编码核糖体RNA的基因为26SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA[15]。利用rDNA的保守序列设计引物，对未知真菌的26SrDNAD1/D2区域序列或ITS区进行PCR扩增，测序后与Genbank中已知序列进行同源性比较，可将真菌划分到属或种。参考文献：[1]王捷,等.动物细胞培养技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2004:1-9[2]翟中和,王喜忠,丁明孝,等.细胞生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:66-67.[3]石凯,熊晓辉,许建生.固定化动物细胞大规模培养技术研究进展[J].化工进展,2002,21(8):556-559.[4]VOIGEA,ZIMLF.Hybridomacellgrowthandanti-neuroblasonamonoclonalantibodyproductioninspinnerfleeksusingaprotein-freemediumwithmicrocarrier[J].JBiotechnol,1999,68(2-3):213-226.[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