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文档简介

ELISA法检测抗-HBs实验目的1.掌握ELISA的原理和操作方法实验原理本实验采用ELISA双抗体夹心法检测抗-HBs-Ag，首先用已知抗HBs抗体包被载体，然后加入待测血清，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，在加入酶标记抗HBs抗体，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。实验材料1.豚鼠Anti-HBs。2.待测血清，阳性，阴性对照血清。3.HBR标记豚鼠Anit-HBs。4.包被缓冲液（0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液）。5.洗涤液（0.01mol/LpH7.4Tris-Cl-Tween20）。6.稀释液（0.01mol/LpH7.4PBS）。7.显色液（邻苯二胺-pH5.0碳酸盐-柠檬酸缓冲液）。8.终止液（2mol/LH2SO4)9.酶仪表、冰箱。实验步骤1.包被用0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液稀释豚鼠Anti-HBs至50µg／ml，然后将稀释好的豚鼠Anti-HBs用微量移液器加入反应板，每孔0.2ml，放湿盒内，置37℃温育2h，在转入4℃冰箱过夜。2.洗涤将包被液到掉后，用洗涤液（0.01mol/LpH7.4Tris-Cl-Tween20溶液洗涤3次，每次持续3min。3.加样将待测血清用稀释液（0.01mol/LpH7.4PBS）稀释（从1：100、1：200至1：6400），然后用移液器分别加入1~7个孔，每孔0.1ml，第8孔加阳性对照血清，第9孔加阴性对照血清，第10孔加PBS做空白对照，将应用板置于37℃孵育2h。4.洗涤同步骤2.5.加酶标记物将酶标记豚鼠Anti-HBs加入反应板，每孔0.1ml，置37℃温育2h。6.洗涤同步骤27显色每孔加显色液（临用前配制）0.1ml，置37℃作用15min。8.终止反应每孔加入2mol/LH2SO40.5ml。实验结果待测孔A值-空白对照孔A值阴性对照孔A值-空白对照孔A值P/N=当P/N≥2.1时判为阳性，以出现阳性结果的最高血清稀释孔的血清稀释度为该血清的（HBs-Ag）效价。将反应板置酶标仪上测定各孔的光密度（A值或OD值），然后按下列公式计算，判断阴阳性结果。注意事项1.包被缓冲液，洗涤液、稀释液等可提前配制，于冰箱中短期保存，使用前观察是否变质。2.加样量力求准确，加样时应将液体加入孔底，避免加在孔壁上部，并出现气泡。3.ELISA操作需要一定温度孵育，为避免蒸发，酶标板上应加盖，或将酶标板平放在底部垫有纱布的湿盒中。4.洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合物

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