微生物学实验

微生物学实验第1页/共105页实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察目的要求显微镜油镜使用的原理实验材料实验程序思考题第2页/共105页目的要求学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识使用油镜观察细菌的几种基本形态用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的运动第3页/共105页显微镜油镜使用的原理普通光学显微镜欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜欧林巴斯（OLYMPUS）相差显微镜第4页/共105页普通光学显微镜Ⅰ显微镜的构造

1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等).它使检视物放大,造成物象.

2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持调节固定等作用.第5页/共105页普通光学显微镜Ⅱ显微镜的放大倍数和分辨率

1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数2.显微镜的分辨率是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2)

式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。第6页/共105页第7页/共105页第8页/共105页实验程序Ⅰ（显微镜的使用）主要是油镜的使用

1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度3.低倍镜观察：粗调、细调4.依次再进行中倍、高倍观察5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

第9页/共105页实验程序Ⅱ（显微镜的使用）显微镜保养和使用中的注意事项：

1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。第10页/共105页实验程序III细菌三种基本形态的观察：

菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。1.结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。2.看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。第11页/共105页实验程序Ⅲ细菌运动性的观察（示范）：一般采用水浸片法、悬滴法、半固体培养法，常用水浸法和悬滴法来观察细菌的运动性。1.水浸片法

2.悬滴法第12页/共105页思考题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？使用油镜时，为什么必须用镜头油？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？第13页/共105页实验二细菌简单染色第14页/共105页一.实验目的和内容目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。内容：1、细菌单染色操作技术2、染色法或负染色法观察口腔中的微生物第15页/共105页二.实验材料和用具

大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。第16页/共105页1、涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1—1．5Cm2(图7—1A、B)。2、干燥将涂片于室温中自然干燥3、固定手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片—在火上烤，否则细菌形态毁坏(图7—1C)。4、染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2rain(图7—1D5、水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图7—1E)。6、干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图7—1F)。7、待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用拍第17页/共105页四、注意事项载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄第18页/共105页实验三细菌的革兰氏染色法第19页/共105页一、目的要求学习并掌握革兰氏染色的方法。第20页/共105页二、实验材料1.菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2.染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液。3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。第21页/共105页三、基本原理

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。第22页/共105页细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。第23页/共105页为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。第24页/共105页

革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。

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另外，与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。第26页/共105页革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫——碘复合物易被抽出，于是被脱色。第27页/共105页

再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。第28页/共105页四、方法与步骤操作过程如下：涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s）→水洗→番红复染（1min）→水洗→干燥→镜检。第29页/共105页第30页/共105页

关键点：

严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。

菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。

第31页/共105页五、实验内容1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色。2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进行革兰氏染色。第32页/共105页大肠杆菌（G-）第33页/共105页枯草芽孢杆菌（G+）第34页/共105页金黄色葡萄球菌与大肠杆菌第35页/共105页六、实验思考题1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时？3.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确，结果可靠？第36页/共105页实验四放线菌、霉菌形态的观察

实验目的：学习丝状微生物制片和染色技术；观察和掌握典型放线菌、重要霉菌和酵母菌的形态结构特征第37页/共105页一、实验材料1、细黄链霉菌5406平板、插片培养材料。2、黑曲霉、青霉、毛霉平板培养材料和湿室培养材料。3、黑根霉（面包霉）装片4、酿酒酵母菌菌液第38页/共105页放线菌形态结构是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因菌落呈放射状而得名。第39页/共105页放线菌的形态和大小放线菌呈分枝丝状菌丝无隔膜，单细胞菌丝直径与细菌相似，小于1微米第40页/共105页放线菌菌丝形态和功能菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种

产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。第41页/共105页问题如果按照细菌的制片方法观察放线菌，看到的情况如何？如果要观察放线菌全貌，可采取什么方法？第42页/共105页放线菌的培养与观察方法

插片法-水封片法玻璃纸法压片法影印法第43页/共105页霉菌的形态结构观察霉菌（mould，mold）——凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。第44页/共105页霉菌的营养体由分支或不分支的菌丝构成。许多菌丝相互交织形成菌丝体。菌丝的大小：直径约为2～10μm，在光学显微镜下，菌丝细胞呈管状。霉菌的形态和大小

第45页/共105页霉菌的菌丝从结构来看，霉菌的菌丝有两种：无隔菌丝：低等霉菌如根霉、毛霉等有隔菌丝：高等霉菌如青霉、曲霉等在功能上，霉菌的菌丝已有分化，可分为：①营养菌丝：②气生菌丝：③繁殖菌丝：第46页/共105页霉菌的繁殖方式和繁殖结构霉菌主要靠形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖。霉菌的无性孢子厚垣孢子节孢子分生孢子孢囊孢子

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根霉产淀粉酶等，用于甜酒的酿制生产多种有机酸转化甾体类物质第48页/共105页

毛霉产蛋白酶、淀粉酶等，用于腐乳的酿制生产多种有机酸转化甾体类物质第49页/共105页曲霉产蛋白酶、淀粉酶等，用于酱油的酿制生产多种有机酸产毒素第50页/共105页青霉生产青霉素纤维素酶和有机酸等果品腐烂产生毒素青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。分生孢子颜色为青绿色。第51页/共105页霉菌的培养观察方法霉菌的载玻片湿室培养与观察p62-63根霉假根的培养粘片观察简易观察第52页/共105页

二、实验内容与要求1、观察细黄链霉菌插片法培养材料2、用压片法观察细黄链霉菌菌丝3、观察黑根霉插片法培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子大小形态、假根、囊托和囊轴），4、观察毛霉湿室培养材料（菌丝有无横隔、孢囊和孢囊孢子、有无假根、囊托和囊轴）5、观察自制黑曲霉装片和湿室培养材料（菌丝有无横隔、分生孢子梗着生位置、顶囊、分生孢子的位置、足细胞等）6、观察青霉湿室培养材料（菌丝有无横隔、分生孢子梗和分生孢子穗形态、有无足细胞等）7、水浸片法（美兰染色法）观察酵母菌形态、大小、芽殖、计算酵母细胞的存活率。第53页/共105页实验报告绘出5406放线菌、黑根霉、黑曲霉、青霉、毛霉的形态结构，注意标明各部分名称。除了培养特征外，请设计一个方案可快速地从显微特征方面把根霉、毛霉、曲霉和青霉鉴定出来。第54页/共105页

实验七酵母菌的形态观察

第55页/共105页目的要求：

1、观察酵母菌的形态及出芽生殖，

2、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

第56页/共105页1、基本原理：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的，而死细胞或衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。第57页/共105页美蓝浸片的观察：（1）在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。（2）加盖玻片。注：不要产生气泡。（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。第58页/共105页（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。（5）绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征，并计算0.5h后酵母菌的死亡率。

第59页/共105页酵母菌第60页/共105页实验六培养基的配制与灭菌了解配制微生物培养基的基本原理；掌握配制、分装培养基的方法。通过常用细菌培养基的配制，了解常规配制培养基的方法；并学会各类物品的包装、配制和灭菌。1.实验目的2.实验原理本实验除了配制培养基以外，还必须准备各种无菌物品，包括培养皿、移液管的包装，稀释水的准备等。第61页/共105页3.实验方法和步骤（1）玻璃器皿的准备培养皿的包装、移液管的包装、棉塞的制作、稀释水的配制（2）培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂2.0g，水100ml，pH7.2-7.4。灭菌条件：121℃，15－20min。称量、加热溶解、调节pH、分装、加棉塞、斜面、灭菌第62页/共105页思考题②了解加压蒸汽灭菌的原理和方法。①配制培养基的基本步骤有哪些?应注意什么问题?第63页/共105页实验七微生物直接计数法（血球计数板）一、目的要求二、基本原理：此法是利用血球计数板在显微镜下直接进行测定。它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。这样得出结果往往偏高。这种方法常用于形态个体较大的菌体或孢子。第64页/共105页计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。计数室刻度有2种：一种是25中格X16小格，而另一种为16中格X25小格，它们都是由400个小格组成。每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml。第65页/共105页****#####第66页/共105页三、材料与仪器：1、待测样品：酵母菌悬液2、显微镜，血球计数板，接种环,盖玻片等。第67页/共105页四、方法与步骤:1、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。2、取稀释到一定程度（5~10个酵母/小格）酵母液，从盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不能有气泡。先在低倍镜下找到小方格网后，再转换高倍镜观察并计数。3、如用16X25计数板，只计四个角上中方格的菌数。若是25X16的计数板，除计数四个角上的中格菌数外，还要计算中央中格的菌数。每个样品重复计数2~3次。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。第68页/共105页4、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。5、计数方法：样品中菌数/ml=每小格平均菌数x4000,000x稀释倍数，本实验采用25x16规格，要求数这些方格中的全部小格即80个小格。设：每个中方格的菌数为A，则每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80

A1+A2+A3+A4+A5样品中的菌数/ml=X4000,000X稀释倍数80

第69页/共105页结果记录：微生物名称总菌数个/ml第一个中格第二个中格第三个中格第四个中格第五个中格第一次测定第二次测定平均第70页/共105页四、测定注意事项:1、测定时，酵母菌液要摇匀，防止酵母凝聚沉淀。2、活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。3、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。第71页/共105页五、思考题：1、用血球计数板计数时，哪些步骤易造成误差？2、血球计数板测定原理是什么？它有哪些优点？第72页/共105页实验八、化学药物对微生物的作用一、实验目的：了解抗生素对微生物的杀灭作用。二、实验原理：抗生素等化学药物对微生物具有抑制或杀灭作用。因此在实际生活中常用化学药物进行杀菌。不同种类的化学物质对微生物的杀菌能力不一样，作用条件也有差别，其效果也不同，在使用时需要灵活选择。三、实验器材：1.活材料：大肠杆菌、枯草杆菌斜面菌种。2.培养基及试剂：牛肉膏蛋白胨培养基、HgCl2、庆大霉素和青霉素。第73页/共105页3.器材：无菌平皿、无菌水、无菌吸管、玻璃刮铲、无菌镊子、无菌圆形滤纸片。四、实验方法：1.倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基按无菌操作法倒入平皿使其冷却成平板。2.制备菌悬液：取无菌水2支，用接种环分别取大肠杆菌和枯草杆菌各2环接入无菌水，充分混匀制成菌悬液。3.接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。4.加药剂：将灭菌滤纸片浸入供试药剂中吸取药液，然后将滤纸片取出（将药液沥干），然后将滤纸片平铺于平板上，并在平板上做标记。（注意不同药剂之间保持一定的距离）。第74页/共105页第75页/共105页5.培养：将平皿置于28℃下培养48h后观察结果。五、作业：取出培养皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈生成，并测量抑菌圈的大小，将测量结果填入下表。不同抗生素对细菌的抑菌效果（抑菌圈直径）细菌化学药物庆大霉素青霉素HgCl2大肠杆菌枯草杆菌第76页/共105页实验九土壤微生物的分离和培养（综合实验）目的要求实验原理实验材料实验步骤实验结果思考题第77页/共105页目的要求初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本方法。

练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。第78页/共105页实验原理土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离第79页/共105页第80页/共105页实验材料样品：新鲜土壤。培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。试剂：1万U/mL链霉素液、10％苯酚第81页/共105页实验步骤稀释涂板法稀释混合平板法（混菌法）划线分离微生物的培养第82页/共105页制平板：每组制培养皿3付。

在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。第83页/共105页实验步骤1（微生物的分离—稀释涂平板法）制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范）1.称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。

2.另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4、10－5、10－6土壤稀释液。

在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管第84页/共105页图－1土壤稀释液的制备和稀释液的取样第85页/共105页吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5、

10－6土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。涂板

用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。计算出每克土壤中细菌的数量。

即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。挑取单个菌落，进行划线分离。第86页/共105页实验程序7（微生物的分离—平板涂抹法）第87页/共105页实验程序2（微生物的分离—混菌法）制平板吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10－4、10－5、

10－6土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。混菌

水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。计算出每克土壤中放线菌的数量。挑取单个菌落，进行划线分离。第88页/共105页实验程序3（微生物的分离—平板划线法）制成平板。凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－1）在平板上划线。

1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。

2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。第89页/共105页第90页/共105页实验程序10（微生物的接种方法）接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图－6）。图－6第91页/共105页思考题平板培养时为什么要把培养皿倒置？在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？第92页/共105页实验十水质的微生物检测（综合实验）实验目的了解水质微生物检验的原