微生物学检验课稿

微生物学检验课稿第1页/共57页第十章食品微生物学检验第2页/共57页主要内容第一节采样第二节显微镜检验第三节培养检查第四节生化试验第五节血清学检验第六节动物试验第七节菌落总数测定第八节大肠菌群测定第3页/共57页第一节采样一、采样

采样是从待鉴定的一大批食品中抽取小部分用于检验的过程。采样必须具有代表性。（一）固体样品乳和乳制品肉及肉制品生肉及器脏熟肉及灌肠类肉制品第4页/共57页蛋制品鲜蛋鸡全蛋粉、巴氏消毒全蛋粉、鸡蛋黄粉、鸡蛋白片断冰鸡全蛋、巴氏消毒的冰鸡全蛋、冰蛋黄、冰蛋白（二）液体样品原包装瓶样品取整瓶，散装样品可用无菌吸管或匙采取。冷冻液体食品，采取原包装，放入隔热容器内。（三）罐头根据厂别、商标、品种来源等分类进行采取原包装样品。第5页/共57页（四）注意事项采样时，首先要了解采样食品的来源、生产时间、批号、加工、贮藏、包装、运输等情况；采样的器械和容器须灭菌后才可使用。采样时严格进行无菌操作；不得加防腐剂；液体食品需搅拌均匀后采取，固体样品要在不同部位采取，使样品尽量具有代表性；取样后，应及时送检，最多不得超过4h。第6页/共57页二、处理（一）固体样品用无菌刀、剪或镊子称取不同部位样品10g，剪碎，放入无菌容器内，加定量水，制成1：10混悬液，进行检验。（二）液体样品1.原包装样品用点燃的酒精棉秋消毒瓶口，再用消毒过的纱布将瓶口盖上，开启后，用无菌吸管直接吸取。第7页/共57页2.含二氧化碳的液体样品同上方法开启后，使气体逸出后进行检验。3.冷冻食品融化后检验。（三）罐头1.密闭试验2.膨胀试验3.微生物检验第8页/共57页目的：观察微生物细胞在生活时期原有的形状、大小和确定细胞能否运动等。第二节显微镜检验一、不染色标本检验制片方法压滴法悬滴法在载玻片上滴一滴生理盐水，再滴加少许要观察的含菌液体或少量要观察的固体培养物，使菌体均匀分布，盖上盖玻片即可镜检。将待观察的含菌液体滴在盖玻片上，然后将其翻身，放置在凹孔载玻片上，使液滴悬挂在凹孔室内。在进行不染色标本检验时，一般用普通光学显微镜直接观察。第9页/共57页二、染色标本检查染色标本能显示微生物的形态、排列、一定的构造及某些细胞成分的性质及其分布的位置，可区别活菌与死菌，可鉴别微生物的种类等。三、显微镜直接计数法比例计数法：将已知颗粒浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液的细胞浓度。血球计数板法：用来测定一定容积中菌数的常规方法。第10页/共57页一、培养基的种类培养基是适合于微生物生长发育需要的各种营养成分配制而成的营养基质，可供微生物在其中生长繁殖。第三节培养检查常用培养基基础培养基选择性培养基鉴别培养基特殊培养基第11页/共57页二、微生物接种与培养（一）微生物接种（二）微生物的培养常用方法：涂布法、划线法、倾注法、点植法、穿刺法和浸洗法等。需养培养厌氧培养厌氧罐法加组织的培养基培养法焦性没食子酸法共栖培养法享盖特厌氧操作技术二氧化碳培养法第12页/共57页三、培养结果观察（一）固体培养基上菌落形状观察大小形状边缘表面隆起度颜色及透明度第13页/共57页（二）液体培养基内培养形状的观察混浊度沉淀表面培养液的颜色以及是否产气等（三）半固体培养基中菌落培养特性的观察主要观察微生物需养与运动情况。第14页/共57页四、培养计数法（一）液体稀释法对未知菌样作连续的10倍系列稀释。选择在适宜的3个连续的稀释液中歌曲5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的试管中。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN表，再根据样品稀释倍数即可计算出活菌含量。（二）平板菌落计数法取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前混合均匀，或涂布已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释倍度，即可计算出原菌液的含菌数。第15页/共57页五、一些新技术新方法免疫扩散法RIAELISA和免疫传感器ELISA双抗夹心法PCR技术第16页/共57页一、糖类代谢试验（一）糖发酵试验不同的微生物可对各种糖类、醇类、糖苷类等进行分解，但其分解能力和分解产物均因不同的微生物而不同。第四节生化试验第17页/共57页常用于糖发酵试验的糖类、醇类和糖苷类：糖类名称戊糖（C5H10O5）阿拉伯糖（Arabinose）木糖（xylose）鼠李糖（rhamnose）己糖（C6H12O11）葡萄糖（glucose）

果糖（fructose）

甘露糖（mannose）

半乳糖（galactose）三糖类（（C8H10O5）3）棉子糖（raffinose）

落叶松糖（melizitose）第18页/共57页糖类名称双糖类（C12H22O11）麦芽糖（maltose）

乳糖（lactose）

蔗糖（sucrsoe）

海藻（trehalose）纤维二糖（cellobiose）

蜜二糖（melibiose）多糖类（（C6H10O5）3）菊糖（inulin）

淀粉（starch）

肝糖（glycogen）

糊精（dextrin）第19页/共57页糖类名称三元醇（C3H5（OH）3）甘油（glycerol）四元醇（C4H6（OH）4）赤霉糖醇（erythitol）五元醇（C5H7（OH）5）核糖醇（adonitol）六元醇（C6H7（OH）6）阿拉伯胶醇（Arabitol）

甘露醇（mannitol）

半乳糖醇（dulcitol）

山梨醇（sorbitol）环己六醇（（CHOH）8）肌醇（inositol）糖苷类水杨苷（salicin）

七叶苷（aescukin）

松柏苷（coniferin）第20页/共57页二、蛋白质及氨基酸代谢试验（二）甲基红（MOR）试验（三）V－P（Voges-Proskauer）试验（四）β－半乳糖苷酶试验（一）靛基质（吲哚）试验（二）硫化氢试验（三）尿素酶（四）氨基酸脱氢酶试验（五）苯丙氨酸脱氨试验第21页/共57页三、呼吸酶类试验（一）硝酸盐还原试验（二）氧化酶（细胞色素氧化酶）试验（三）过氧化氢试验四、有机酸盐及铵盐利用试验（一）柠檬酸盐利用试验（二）丙二酸盐利用试验第22页/共57页五、毒性酶类试验（一）软磷脂酶试验（二）血浆凝固酶试验（三）链激酶试验六、其他生化试验（氰化钾抗性试验）氰化钾（KCN）是呼吸链末端抑制剂，常用于肠杆菌科各属的鉴别。第23页/共57页第五节血清学检验血清学检验是根据抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一定条件下出现各种抗原－抗体反应的现象，用于检验抗原或抗体的技术。

血清学检验技术发展迅速，主用应用于：传染病诊断、病原微生物分类鉴定、抗原分析、毒素与抗毒素测定等方面。第24页/共57页一、抗原

凡是能刺激有机体产生抗体，并能与相应抗体发生特异性结合的物质，称为抗原（antigen）。这一概念包括两个基本内容，一是刺激有机体产生抗体，通常称之为抗原性（antigenicity）或免疫原性(immunogenicity)。另一是能与相应抗体发生特异性结合，称为反应原性(reaginicity)。第25页/共57页（一）抗原的性质

异物性大分子量特异性完整性第26页/共57页１.完全抗原（completeantigen）:能在机体内引起抗体形成，在体外可与抗体发生特异性结合，并在一定条件下出现可见反应的物质。如细菌、病毒等微生物蛋白质和外毒素等。(二)抗原种类２.不完全抗原（incompleteantigen）或称半抗原（hapten）:也称之为办抗原（hapten），不能单独刺激机体产生抗体，需与蛋白质或胶体颗粒结合后，可刺激机体产生抗体，但在试管内可与相应抗体发生特异性结合，并在一定条件下出现可见反应的物质。第27页/共57页３.细菌抗原表面抗原菌体抗原鞭毛抗原外毒素和类毒素菌毛抗原第28页/共57页二、抗体

抗体(antibody)是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，亦称免疫球蛋白(immunoglobulin，简称Ig)。含有免疫球蛋白的血清，通常被称为免疫血清或抗血清。第29页/共57页抗体的结构第30页/共57页抗体是一些具有免疫活性的球蛋白在试管内能与相应抗原发生特异性结合抗体的分子量都很高（一）抗体的性质第31页/共57页

１、根据其理化性质和结构分（二）抗体的种类第32页/共57页第33页/共57页第34页/共57页第35页/共57页第36页/共57页２.根据其抗体获得方式分

3.根据作用对象不同

4.根据与抗原接合后的可见反应不同第37页/共57页三.抗原抗体反应（血清学反应）

抗原与抗体无论在体外或体内均能发生特异性结合，根据抗原性质，反应条件及其参与反应因素，表现为各种反应，统称为免疫反应。若这种反应表现在体外则称之为血清学反应。

第38页/共57页（一）血清学反应的一般特点

1、特异性和交叉性

2、可逆性

3、结合比列

4、敏感性

5、阶段性血清学反应特点及用途（表）第39页/共57页反应类别反应名称敏感性抗体Ug/ml用途定性定量定位抗原分析沉淀反应环状沉淀反应3～20++－－免疫电泳3～20+－－++双向双扩散0.2～1.0+－－－单向单扩散0.008～0.025++－+凝集反应细菌凝集反应0.01++－－间接血球凝集反应0.005++－－抗球蛋白试验0.0045++－－补体参与反应免疫溶血反应0.001～0.003++―－不提结合反应0.01～0.1++－―免疫粘附血球凝集试验0.0005++－－标记抗体技术荧光抗体技术+－+－酶标记抗体技术++++放射免疫技术0.0001～0.001+++－中和反应病毒中和反应0.0004～0.001++－－杀菌反应0.00001～0.00001++－－第40页/共57页（二）影响血清学反应的条件

1、电解质2、温度

3、pH值

4、杂质异物第41页/共57页四、血清学反应的应用（一）凝集反应

1、直接凝集反应（1）玻片法：通常为定性试验，用抗体测未知抗原，如鉴定菌种，测人类红细胞ABO血型等。（2）试管法：定量试验，用抗原测雪青中有无某种抗体及相对含量。2、间接凝集反应利用某些与免疫无关的均一小颗粒物质作为载体，将可溶性抗原（抗体）吸附于表面，在有电解质存在适宜条件下，与相应抗体（抗原）结合，发生凝集现象。第42页/共57页（二）沉淀反应

1、环状法常用于抗原定性试验2、絮状法3、琼脂扩散法（1）单向扩散：常做抗体定量试验。试验时抗体预先在琼脂中混匀，浇铸成平板打孔，抗原注入小孔（图）（2）双向扩散：琼脂浇铸成平板打孔，抗原、抗体分别注入小孔。（图）第43页/共57页单向琼脂扩散第44页/共57页双向琼脂扩散第45页/共57页凝集反应与沉淀反应的比较

沉淀反应凝集反应抗原体积小总面积大体积大总面积小大抗体需要少需要多

第46页/共57页（三）免疫电泳

将琼脂扩散和电泳技术结合的血清学检验方法。1、对流免疫电泳：双向扩散与电泳技术结合（图）

2、火箭电泳：单向扩散与电泳技术结合（图）

3、琼脂免疫电泳：先电泳，后双向扩散（图）第47页/共57页对流免疫电泳第48页/共57页火箭电泳第49页/共57页免疫电泳第50页/共57页（四）补体结合反应指示系统反应系统补体第51页/共57页（五）免疫标记技术1、免疫荧光标记技术用荧光素对抗体（或抗原）进行标记，然后用于免疫学测定。（1）直接