微生物技术应用背景知识一显微技术

微生物技术应用背景知识一显微技术第1页/共35页微生物技术应用背景知识一：显微技术第2页/共35页思考：Q：微生物体积很微小,我们人类无法用肉眼看到，那应该怎样观察呢？A：由于我们人眼无法观察到微生物，所以通常用显微镜来观察。在日常生活中，使用比较广泛的是普通光学显微镜。第3页/共35页知识节点一显微镜的种类和用途知识节点二光学显微样品的制备知识节点三光学显微镜的使用第4页/共35页知识节点一显微镜的种类和用途1普通光学显微镜部件构成？2普通光学显微镜的原理3普通光学显微镜有哪些？第5页/共35页镜座镜臂镜台载物台平台

目镜物镜光源调节旋钮第6页/共35页光学系统目镜物镜聚光镜1．目镜（也称为接目镜）位置作用构成第7页/共35页2．物镜（也称为接物镜）决定着光学显微镜分辨率的高低位置数值孔径（numericalapeature简写为NA）

数值孔径越大，物镜的性能越好。第8页/共35页3．聚光镜（又称为聚光器）位置作用调节聚光镜的上下，保证使用不同厚度的玻片焦点落在被检标本上。调整聚光镜上附有虹彩光阑（俗称光圈）的大小，可以调节进入物镜光线的强弱。第9页/共35页第10页/共35页2．显微镜的放大倍数被检物体经显微镜的物镜和目镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。例如用放大40倍的物镜和放大10倍的目镜的总放大倍数是400倍。第11页/共35页3．分辨率物镜前面发光点发射的光线进入物镜的角度称为开口角度。透镜的放大率与开口角度成正比，与焦距成反比。数值口径（NA）是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。

NA=n×sinβ第12页/共35页评价一台显微镜的质量：放大倍数，

分辨率。分辨率指显微镜能够辨别发光的两个点或两根细线间最小距离的能力。该最小的距离称为鉴别限度（R）：R=λ/2nsinβ=λ/2NA由此可见，R值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。提高分辨力的方法：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角。第13页/共35页4．工作距离工作距离是指观察标本最清晰时，物镜透镜的小表面与标本之间（无盖玻片时）或与盖玻片之间的距离。物镜的放大倍数越大，其工作距离越短，油镜的工作距离最短，约为0.2mm。所以使用油镜时，要求盖玻片的厚度为0.17mm。第14页/共35页5．目镜的放大倍数显微镜的有效放大倍数是：E×O=1000×NAE=1000NA/OE为目镜放大倍数，O为物镜放大倍数第15页/共35页普通光学显微镜的种类

1暗视场显微镜装配有特殊聚光器2相差显微镜3荧光显微镜4微分干涉显微镜5视频反差增强显微镜6激光扫描共焦显微镜第16页/共35页

知识节点二光学显微观察样品的制备制片是关键，染色是核心1怎样制片？应注意什么？2常用怎样的染色方法？怎样染色？应注意什么？第17页/共35页一、制片

步骤：清洁→涂片→干燥→固定→染色→冲洗→吸干清洁：洗衣粉水清洗→清水冲洗→洗液浸泡24h以上→流水充分冲洗→烤干备用2.涂片第18页/共35页制片的关键是载片要洁净，不得沾污油脂，菌体才能涂布得薄而均匀。3．干燥自然干燥。4．固定已干燥的涂片标本向上，在微火上过3-4次进行固定。固定的作用为：（1）杀死细菌（2）使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载玻片上，染色时不被染液或水冲洗掉（3）增加菌体对染料的结合力，使涂片容易着色。第19页/共35页5．染色涂菌部分滴加染液，染色一定时间。6．冲洗7．吸干8．镜检第20页/共35页（一）简单染色法——最简单的染色方法1.染色原理常用染料有美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等。2.染色步骤（涂片干燥固定）染色（冲洗吸干）

在涂片处滴加草酸铵结晶紫液1-2滴使其布满涂菌部分染色1min

二、染色第21页/共35页革

兰

氏

染

色

法涂片固定1.单染—结晶紫染液第一次染色

1min

第22页/共35页2.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30-60S3.脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱4.复染—红色的藩红染液第二次染色

第23页/共35页呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G-）细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G＋）；第24页/共35页2.染色原理革兰氏染色由1884年丹麦医师Gram所发明第25页/共35页第26页/共35页

知识节点三光学显微镜的使用准备→放置显微镜→调节光源→低倍镜观察→高倍镜观察→油镜观察→清理第27页/共35页一、准备工作及观察要求1．以镜座后端离实验台边缘3-6cm为宜。2．检查镜的各个部件是否完整和正常。3．使用显微镜观察标本时，要求左手调焦、右手移片或绘图记录。二、显微镜的放置显微镜应直立放置在桌上，不要将直筒显微镜倾斜。第28页/共35页三、光源的调节要求显微镜不能采用直射阳光。放大倍数越高，所需光源越强。调节方法通常调节照明主要通过选择平面或凹面反光镜、调整聚光器高度、开闭聚光镜上的孔径光阑、调节照明度控制钮，来选择最佳的照明效果。第29页/共35页四、低倍镜找观察目标1．放置标本2．调焦：3.调整物象位置：使用移片器的螺旋移动标本的位置使物像进入视野并移至中央。第30页/共35页五、用高倍镜观察1．先用低倍镜寻找到需观察的物像2．转动物镜转换器通常显微镜在低倍镜准焦的状态下可以直接转换高倍镜观察。有时高倍物镜会碰擦玻片而不能转换到位，应检查玻片是否放反、玻片是否过厚以及物镜是否松动等。如果调整后仍不能转换，则是由于高倍镜过长，此时应将载物台下降或使镜筒升高后再转换，然后重新前面的操作。第31页/共35页六、油镜的使用方法1．用高倍镜找到所需观察的标本物像，并将需要进一步放大的部分移至视野中央。2．将光线调强：将聚光器升至较高位置、光圈开至最大。3．转开高倍镜，往玻片标本上需观察的部位滴一滴香柏油或石蜡油作为介质，然后从侧面观察，使油镜转至工作状态，此时油镜的下端镜面一般应正好浸在油滴中或与油滴接触。第32页/共35页4．小心而缓慢地转动细调螺旋使至视野中出现清晰的物像。5．油镜使用完后，必须及时将镜头上的油擦拭干净。用擦镜纸擦拭→用檫镜纸沾清洁剂或二甲苯擦→用干擦镜纸擦。玻片标本上的油，如果是有盖玻片的永久制片，可直接用上述方法擦干净；如果是无盖玻片的标本，则载玻片上