微生物的纯培养及显微技术

微生物的纯培养及显微技术第1页/共57页Chapter2微生物的纯培养及显微技术Sect1微生物的分离和纯培养一、前言二、微生物操作基本技术——无菌技术三、微生物的分离和纯培养四、微生物的保藏技术第2页/共57页一、前言1、微生物研究对象：群体2、研究基础：

1）纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。

●培养物：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。●纯培养物：只有一种微生物的培养物。

2）显微技术：包括显微标本的制作、观察、测定、分析和记录。第3页/共57页培养基第4页/共57页二、微生物操作基本技术——无菌技术1、微生物培养的常用器具及其灭菌1）常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿、接种环（针）、无菌操作台、酒精灯等2）灭菌：

●灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方法。即采用强烈的理化因素使任何物体内、外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。它比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。如高温、辐射、超声波和激光等。

第5页/共57页●消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。即仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的生物基本无害的措施用以消毒的药品称为消毒剂(disinfectant）●抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。●防腐(antisepsis)：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖而对被消毒的物体基本无害的措施。如低温、缺氧、干燥、高酸、高渗或防腐剂。细菌一般不死亡。●无菌(asepsis)：不存在活菌。第6页/共57页（1）常用物理消毒灭菌方法

●热力灭菌法；●辐射杀菌法；●滤过除菌法；●超声波杀菌法。

A、

热力灭菌法●干热灭菌法▲焚烧：废弃物、尸体；▲灼烧：接种环、试管口；▲干烤：玻璃器皿；▲红外线：医疗器械。●湿热灭菌法

Ⅰ）常压下：●巴氏消毒法：61.6-62.8℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。●煮沸法；第7页/共57页巴氏消毒的方法有几种？一种是将牛奶加热到62-65℃，保持30分钟。这种方法目前在广东较少使用。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%-99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌占多数的是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75-90℃，保温15-16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。

第8页/共57页●间歇蒸汽消毒法：80-100℃15-60min,37℃过夜，循环三次。主要适用于不耐热培养基灭菌。Ⅱ）加压下：●连续加压灭菌：135-140℃下处理5-15s，主要适用于大规模的发酵工厂培养基灭菌；●常规加压灭菌：121℃（压力：1kg/cm2或15磅/英寸）15~20min，是一种最为广泛的灭菌方法。▲注意灭菌物体含菌量的影响，含菌量越高灭菌时间越长。天然原料＞化学试剂▲空气的排除程度，必须尽量驱尽锅内空气。是依靠温度而不是压力来达到灭菌的目的。

15磅/英寸：纯蒸汽121℃；排除1/2空气：112

℃；不排除空气：100

℃。第9页/共57页灭菌锅第10页/共57页

▲灭菌对象体积；50ml(12min),2000ml(30min)▲灭菌对象pH值：pH＜6.0最易死亡；而pH6.0~8.0时，微生物最不易死亡。

▲加热与散热的速度。

B、辐射杀菌法；

●

紫外线：波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。

●电离辐射：高速电子、X射线、γ射线

第11页/共57页洁净工作台第12页/共57页●微波：波长1mm~1mC、过滤除菌法

●赛氏滤器；●玻璃滤器；●薄膜滤器

D、超声波杀菌法

●是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。

第13页/共57页超声仪第14页/共57页（2）化学消毒剂：●消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂。●消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。第15页/共57页3）接种操作●用接种环或接种针分离分离微生物或在无菌条件下把微生物由一个培养皿转接到另一个培养皿进行培养。

图-2-1无菌操作转接培养物无菌操作箱紫外照射30min以上；靠近火焰。第16页/共57页三、微生物的分离和纯培养●菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。●菌苔：许多菌落连成一片称为菌苔。●培养基：培养微生物的营养物质。常用的有：肉汤、LB培养基等。●固体培养基：用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基。常用1.5%琼脂。●平板：即培养平板的简称，它是指熔化的固体培养基倒入平皿冷却凝固后，盛有固体培养基的培养皿。第17页/共57页一）优势微生物分离纯培养1、用固体培养基分离纯培养●稀释倒平板法

缺点：热敏感细菌易死亡；影响严格好氧菌的生长。●涂布平板法注意：平板不能太干也不能太湿，同时不能损坏平板。

●平板划线分离法

★扇形；★连续划线；★方格划线。注意：不能损坏平板。●稀释摇管法

★适宜于严格厌氧菌；★步骤同稀释倒平板法。第18页/共57页第19页/共57页灭菌液体石蜡何固体石蜡的混合物第20页/共57页2、用液体培养基分离纯培养

★适宜于不能在固体培养基上生长的微生物如一些细胞大的细菌、原生动物和藻类；

★最后一个稀释度95%表现为不生长。二）劣势微生物分离纯培养

1、单细胞分离

★必须借助于低倍显微镜（较大的微生物）或显微操作仪

（较小的微生物）；

★对操作技术要求高，多限于高度专业化的科学研究。

第21页/共57页2、选择培养分离★适宜于从自然界中分离、寻找有用的微生物或劣势生长微生物。1）利用选择培养基直接分离●原理：根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。如分离高温菌，可在高温条件下培养；分离某种抗生素的抗性菌株可在加有抗生素的平板上分离。2）富集培养●原理：利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物生长（即抑制大多数微生物的生长），从而使其在群落中的数量大大增加，进而对其进行分离。如分离降解对羟基苯甲酸的微生物配置以对羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基。

第22页/共57页★富集培养是分离微生物最强有力的手段之一。它可以用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物。第23页/共57页三）二元培养物分离●二元培养物：如果培养物中只含两种微生物，而且有意识地保持其二者之间特定关系的培养物称为二元培养物。

★适宜于不能或很难得到纯培养的微生物。

★如病毒是二元培养物保存的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。四）不同的微生物有不同的最适方法，在实践中根据需要采取其最适方法。第24页/共57页四、微生物的保藏技术1）目的：为了保证微生物研究和应用工作的顺利进行，通过分离纯化的微生物必须通过各种保藏技术保藏。2）要求：不死；不被污染；不变异。3）原理：根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物以特定的条件，使其存活而得以延续。

A：利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续接种；

B：改变其所处的环境条件如干燥、低温、缺氧等令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，使其在一定时间内得以保存。第25页/共57页4）保藏方法（1）传代培养保藏●类型：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养基●注意：A，在规定时间内接种（一般1个月）

B，降低培养物的代谢或防止培养物干燥可延长传代保藏的时间。

●优点：使用方便。●缺点：

★工作繁琐；★容易污染；★易导致菌种的衰退。

第26页/共57页（2）冷冻保藏●原理：将微生物处于冷冻状态使其代谢作用停止以达到保藏的目的（降低温度）。●方法：★液氮（-196℃）；★-70℃低温冰箱；★-20℃普通冰箱（温度越低越好）●注意：尽量减小冰晶对细胞（主要是细胞膜）的损伤。★速冻；★快速升温；

★加保护剂如甘油（可加到15-50%），二甲亚砜。第27页/共57页液氮罐第28页/共57页

（3）干燥保藏法●原理：干燥使其代谢停止（减少水分）。●方法：

★沙土管保存：适用于产孢子的微生物如芽孢杆菌、放线菌等。特点：简便易行，并可以将微生物长期保藏。适合于一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。

★冷冻真空干燥保存：冷冻干燥样品在真空或惰性气体密闭环境中保存，使其生命活动处于休眠，可以达到长期保存的目的。特点：用冰升华除去水分手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果不错，同时邮寄和使用方便。它是目前使用最普遍、也是最重要的的微生物保藏方法。

第29页/共57页（4）其它方法

●各种微生物保藏的方法还很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。

总之●不同的微生物对不同保藏方法有不同的适应性，迄今还没有一种方法被证明对所有的微生物都适应。

●对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法失败而导致菌种的丧失。第30页/共57页Sect2显微镜和显微技术一、显微镜的种类及其原理一）光学显微镜

1、普通光学显微镜（lightmicroscope)

●适于观察染色的标本

2、暗视野显微镜（dark-fieldmicroscope)

●适于观察细菌的运动性

3、相差显微镜（phasecontrastmicroscope)

第31页/共57页●通过特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的的干涉现象，将光的相位差转变成肉眼可以觉察的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。●适于观察不染色的活细胞及细胞内的某些细微结构。4、荧光显微镜（fluorescencemicroscope)

●原理：是紫外线、荧光素（如FITC）、抗体分子（必要时）一起工作的显微镜。标本用用荧光素覆盖，紫外线直接照射标本。紫外线将荧光染料中的电子激发，使之呈高能量水平。然后电子返回到它们初发的能量水平时，通过发射不同颜色的光来释放额外的能量。

●在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍如抗原组织定位等。第32页/共57页

普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。第33页/共57页暗视野显微镜第34页/共57页相差显微镜第35页/共57页荧光显微镜第36页/共57页（一）形态和染色球状杆状螺旋状基本形态第37页/共57页一、细胞的形态构造及其功能（一）形态和染色1、球状

细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。第38页/共57页一、细胞的形态构造及其功能（一）形态和染色2、杆状

细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。第39页/共57页枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌第40页/共57页铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）第41页/共57页结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis第42页/共57页炭疽病的病原菌

-------炭疽杆菌第43页/共57页破伤风梭菌第44页/共57页一、细胞的形态构造及其功能（一）形态和染色3、螺旋状弧菌螺旋菌螺旋体菌第45页/共57页弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。蛭弧菌霍乱弧菌第46页/共57页螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生细胞壁坚韧，菌体较硬。第47页/共57页螺旋体菌：菌体柔软，用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。梅毒密螺旋体第48页/共57页个体小:测量单位：微米或钠米火星陨石中发现的细菌化石（直径10nm）第49页/共57页

德国科学家H.N.Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌

(sulfurbacterium),其大小可达0.75

mm，Thiomargaritanamibiensis,---“纳米比亚硫磺珍珠”第50页/共57页二）、电子显微镜1、透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope,TEM)●原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够检测极细微的物体，如病毒和分子。●应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）2、扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope,SEM)●原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电