微生物限检验及控制

微生物限检验及控制第1页/共32页微生物限度检验及控制第2页/共32页教程目的GMP检查中常见的缺陷微生物限度检查的定义微生物限度检查的样品处理微生物限度检查用培养基及其灵敏度检查微生物限度检查方法和验证第3页/共32页1－GMP检查中常见的缺陷XXX止咳糖浆中含有防腐剂，但成品的微生物限度检验操作规程未严格按照2000年版《中国药典》的要求制定，未考虑到防腐剂对试验的影响，检验方法不合理。纯化水微生物限度检测方法未验证，实际检测方法不合理，样品被稀释了1660倍后再用直接接种法进行检测。微生物限度检查的原始记录缺少所用培养基的名称、配制批号。注射用水、纯化水检测中，未按2005版药典要求进行霉菌和酵母菌数的检验。第4页/共32页2.定义测定所有药用材料（从原料到成品）中需氧微生物的数量的方法证明所有药用材料（从原料到成品）中无特定微生物的方法。第5页/共32页3.取样及样品处理我们期望什么?在整批产品中特定微生物的数量。我们做的是什么测试?限度是一个破坏性的实验–我们不能对整批进行100%检验。如何通过检验来证明整批产品的微生物数量？要求有一个取样计划来涵盖整个批号。有足够的取样量和检验量无抑菌因素第6页/共32页如何对批进行取样？样品必须具有批代表性：最易污染的位置取样：批开始、结束及重大故障和调整后连续性随机性上述取样过程要有文件规定和记录3.1取样及样品处理_取样计划第7页/共32页取多少样（检验数量）?药典规定检定量是：10克或10毫升同时要考虑检验损耗和复试3.2取样及样品处理_取样量第8页/共32页目的溶解：避免读数时的干扰匀质：保证检验量消除抑菌因素：提高检验灵敏度3.3取样及样品处理_供试液的制备第9页/共32页方法:10ml/g样品，加无菌氯化钠－蛋白胨至100ml,1小时内使用3.3取样及样品处理_供试液的制备无抑菌性水溶性液体样品：无需处理无抑菌性油性液体样品：加聚山梨酯20、80;乳浊液（<45℃,<30min）无抑菌性非水溶性固体体样品：碾磨悬浊,加聚山梨酯80助溶具抑菌活性的供试品：稀释、中和、洗、冲第10页/共32页要有一个完整的取样计划涵盖整个批生产过程，并要考虑到“最坏情况”以提高检出可能性。检验数量和检验量应满足药典要求。样品处理消除干扰、提高灵敏度3.4取样及样品处理_结论第11页/共32页我们期望什么?在整批产品中特定微生物的数量。

我们做的是什么测试?微生物限度检查是通过目检计数微生物在培养基上生长的菌落数来判断结果。如何通过检验来证明整批产品的微生物数量（负载）？能支持微生物生长并无菌_培养基的灵敏度检查。培养基的保存控制无抑制微生物生长的因素存在_方法验证试验4.

微生物限度检查用培养基第12页/共32页细菌：营养琼脂培养基，30-35℃

，培养48小时。霉菌：玫瑰红钠琼脂培养基，23-28℃

，培养72小时。酵母：酵母浸出粉胨培养基，23-28

℃

，培养72小时4.1微生物限度检查用培养基第13页/共32页4.2微生物限度检查用培养基

_灵敏度检查所有培养基必须无菌（阴性对照）配制后用经验证的方法灭菌通过阴性对照每次试验进行控制用代表菌平皿法证明培养基灵敏度－回收率>70%。药典无要求检查频率：每次灭菌批（至少灭菌参数变更后第14页/共32页4.3微生物限度检查用培养基_保存应规定保存有效期:

在密闭容器中一年，非密闭容器中一月2-25°保存确保pH在密闭容器中保存第15页/共32页使用三种微生物培养基有效控制微生物培养基的保存和效期4.4微生物限度检查用培养基_结论第16页/共32页5.微生物限度检查方法药典规定两种方法:平皿法:加1ml样品制备液至无菌平皿中，倒15-20ml,<45℃培养基混匀倒置培养。至少制备2个平板。控制菌落数在30-100CFU（细菌），30-80CFU（真菌）薄膜过滤法

：制备液用0.45m膜过滤并用3x100ml无菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上贴与培养基上。每种培养基制备一张膜控制菌落数<100CFU/膜第17页/共32页若样品本身的混浊，会干扰计数结果要考虑对样品中抑菌因素进行中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接种量限制，试验灵敏度受局限操作简便，设备要求低5.1微生物限度检查方法_平皿法第18页/共32页操作复杂，设备要求高不适用于无法溶解的样品大体积检验量，检验灵敏度不受局限样品中的抑菌因素可被滤除中和试剂可应用在淋洗液中，如：ß-内酰胺酶分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯5.2微生物限度检查方法_薄膜过滤法第19页/共32页

两种方法的共同点:

-培养基和培养温度-培养时间-工作环境：100级区域进行（一般是要求与生产的洁净条件一致）5.3微生物限度检查方法第20页/共32页TSB培养基中增菌培养2天金葡菌：划线甘露醇氯化钠琼脂30－35℃，培养1天。革兰氏染色显微观察。－无阳性球菌大肠、沙门和绿脓：划线麦康凯琼脂30－35℃，培养1天，革兰氏染色显微观察。－无阴性杆菌

控制菌检查:5.4微生物限度检查方法第21页/共32页方法验证试验

_

证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，…

下列情况应进行重新验证：检验方法变更培养基变更（包括，灭菌参数变更）产品处方变更菌种：大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌5.5微生物限度检查方法_方法验证第22页/共32页方法验证试验

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证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，…

下列情况应进行重新验证：检验方法变更培养基变更（包括，灭菌参数变更）产品处方变更挑战菌液：大肠、金葡、枯草，稀释至50-100cfu/ml待用白念、黑曲霉，稀释至30-80cfu/ml待用5.5微生物限度检查方法_方法验证第23页/共32页验证方法：试验组：挑战菌液＋样品制备后进行试验供试品对照组：样品制备后进行试验菌液组：挑战菌液进行试验空白对照组：直接用稀释液进行试验5.5微生物限度检查方法_方法验证第24页/共32页验证合格标准细菌、霉菌及酵母菌计数试验空白对照组无菌生长菌液组无杂菌生长（试验组－供试品对照组）÷菌液组70％控制菌检查试验空白对照组无菌生长菌液组无杂菌生长对试验组的菌落鉴定，确认是所接种挑战菌株5.5微生物限度检查方法_方法验证第25页/共32页报告：（平均计数×稀释倍数）若在1:10稀释样品中没有检出，报告<10cfu/g(ml)若平均值有小数，应取整数后乘稀释倍数，例如：1:10稀释样品：平板1:1cfu;平板2：0cfu;平均为0.5报告结果是10cfu/ml,而不是5cfu/ml5.6微生物限度检查方法_结果判断第26页/共32页结论:有三种检验方法，但所用培养基、培养温度、时间相同检验方法应验证证明，在试验条件下没有抑菌效应5.7微生物限度检查方法_结论第27页/共32页培养基:细菌:大豆胰蛋白琼脂，30-35℃

，培养48小时霉菌酵母：沙氏葡萄糖，20-25℃

，培养5天6.

微生物限度检查_USP介绍第28页/共32页美国药典：多管法6.

微生物限度检查_USP介绍稀释度管1管2管3空白1ml制备稀释液＋9ml培养基1ml制备稀释液＋9ml培养基1ml制备稀释液＋9ml培养基1：101ml制备样品＋9ml培养基1ml制备样品＋9ml培养基1ml制备样品＋9ml培养基A:1ml制备样品＋9ml培养基1：1001mlA＋9ml培养基1mlA＋9ml培养基1mlA＋9ml培养基B：1mlA＋9ml培养基1：10001mlB＋9ml培养基1mlB＋9ml培养基1mlB＋9ml培养基第29页/共32页中国药典中对控制菌检查有类似方法要考虑对样品中抑菌因素进行中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接种量限制，试验灵敏度受局限操作复杂，设备要求高适用于无法溶解的样品6.

微生物限度检查_USP介绍美国药典：多管法第3