外源目的基因表达与调控

外源目的基因表达与调控第1页，共53页，2023年，2月20日，星期四

生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上,基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。第2页，共53页，2023年，2月20日，星期四

外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个重要环节。基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一繁殖加工过程：RNA剪接、5′端加帽、3′端加上poly(A)尾巴。原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较复杂的翻译后加工。第3页，共53页，2023年，2月20日，星期四第一节外源基因表达机制一、外源基因的起始转录外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录，合成mRNA。第4页，共53页，2023年，2月20日，星期四二、mRNA的延伸与稳定性

外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止，可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。第5页，共53页，2023年，2月20日，星期四三、外源基因mRNA的有效翻译

外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：

1.AUG(ATG)是首选的密码子；

2.SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基；

3.SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9个碱基；

4.在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结构。第6页，共53页，2023年，2月20日，星期四

真核细胞mRNA的5′非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列含有共同序列。不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果外源基因的mRNA密码子使用受体的偏好密码子，则表达效率高。

mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码子。第7页，共53页，2023年，2月20日，星期四四、表达蛋白质在细胞中的稳定性

外源基因的表达产物在宿主细胞中的稳定积累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表达量。避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施:1.构建融合蛋白表达系统。

2.构建分泌蛋白表达系统。

3.构建包涵体表达系统。

4.选择蛋白酶缺陷型的受体系统。第8页，共53页，2023年，2月20日，星期四五、基因沉默

基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有较高的同源性。第9页，共53页，2023年，2月20日，星期四第二节基因表达的调控元件一、启动子

启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，一般位于表达基因的上游。

1.序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框。

2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件。

3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因的转录。

4.种属特异性。第10页，共53页，2023年，2月20日，星期四二、增强子

增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。

1.双向性。正反两个方向调节活性。

2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能的重复序列。

3.功能与位置无关。

4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。

5.对异源基因也有调节功能。第11页，共53页，2023年，2月20日，星期四三、终止子

终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录的DNA序列。本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止子。依赖型终止子需要ρ因子的辅助，属于弱终止子。第12页，共53页，2023年，2月20日，星期四四、衰减子衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。第13页，共53页，2023年，2月20日，星期四五、绝缘子绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。第14页，共53页，2023年，2月20日，星期四六、反义子反义RNA是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA。编码反义RNA的DNA称为反义子。反义RNA广泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最普遍。第15页，共53页，2023年，2月20日，星期四第三节外源基因表达与调控

外源基因表达包括目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物(目的蛋白)。外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。第16页，共53页，2023年，2月20日，星期四外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录翻译一、大肠杆菌表达系统第17页，共53页，2023年，2月20日，星期四

R－35－10SD编码序列OriTcrTT启动子起始密码子AUG、GUG、UUG终止密码子UAAU、UGA、UAG大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。(一)大肠杆菌基因表达载体第18页，共53页，2023年，2月20日，星期四核糖体结合位点启动子转录终止子复制起点第19页，共53页，2023年，2月20日，星期四1.复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子靶序列在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。第20页，共53页，2023年，2月20日，星期四2.启动子和终止子

启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。理想的启动子应该具备以下性质：第一,必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上第二,这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件第三,这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。第21页，共53页，2023年，2月20日，星期四外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。终止子第22页，共53页，2023年，2月20日，星期四强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。

对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用第23页，共53页，2023年，2月20日，星期四3.核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。

mRNA翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。

第24页，共53页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’

即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列第25页，共53页，2023年，2月20日，星期四4.密码子不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因在大肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。5.选择标记

大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗性基因。第26页，共53页，2023年，2月20日，星期四(二)宿主菌

外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应的大肠杆菌宿主菌。如BL21。第27页，共53页，2023年，2月20日，星期四（三）常见的大肠杆菌表达系统

目前应用广泛的大肠杆菌表达系统主要有Lac和Tac表达系统，PL和PR表达系统，T7表达系统。

Lac和Tac表达系统是以lac操纵子调控机制为基础构建的表达系统。第28页，共53页，2023年，2月20日，星期四Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列

PlacTTTACATATAAT

PtrpTTGACATTAACT

PtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGT

PlLTTGACAGATACT

PrecATTGATATATAAT启动子第29页，共53页，2023年，2月20日，星期四转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP

负调节因子

lacILac

表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

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lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMPCAP

lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶本底水平转录Lac

表达系统正调节因子CAP

cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与

lac

操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac

介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP第31页，共53页，2023年，2月20日，星期四Lac

表达系统

lacUV5突变体

PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受

lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。第32页，共53页，2023年，2月20日，星期四Lac

表达系统

负调节因子

lacI

在无诱导物情形下，

lacI

基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。

lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶本底水平转录

lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第33页，共53页，2023年，2月20日，星期四Tac

表达系统

tac启动子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平高于trp和lacUV5

启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列

PlacTTTACATATAAT

PtrpTTGACATTAACT

PtacTTGACATATAAT第34页，共53页，2023年，2月20日，星期四lac、tac

启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。

当多拷贝的

lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO

的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。第35页，共53页，2023年，2月20日，星期四lac、tac

启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI

基因的突变体lacIq

被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq

，常被选用为Lac、Tac

表达系统的宿主菌。

但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。

需在表达载体中插入lacIq

基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。第36页，共53页，2023年，2月20日，星期四lac、tac

表达系统存在的问题

IPTG用于诱导

lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录第37页，共53页，2023年，2月20日，星期四lac、tac

表达系统存在的问题

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac

和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。第38页，共53页，2023年，2月20日，星期四

T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。第39页，共53页，2023年，2月20日，星期四

T7表达系统

T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。第40页，共53页，2023年，2月20日，星期四T7表达系统转录调控的机理

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA

聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA

聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因？启动子第41页，共53页，2023年，2月20日，星期四

T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是

l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5

启动子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA

聚合酶IPTG诱导第42页，共53页，2023年，2月20日，星期四T7表达系统存在的问题

T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与

T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。

第43页，共53页，2023年，2月20日，星期四1.包涵体蛋白在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。（四）外源基因在大肠杆菌表达的形式第44页，共53页，2023年，2月20日，星期四以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的优点在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。第45页，共53页，2023年，2月20日，星期四以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的缺点以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质，尤其当目标蛋白分子中的

Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。第46页，共53页，2023年，2月20日，星期四2.融合蛋白

将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的开放阅读框，以这种方式表达的蛋白质称为融合蛋白。外源蛋白与菌体自身蛋白融合表达后稳定性大大增加，避免受到菌体蛋白酶的降解。第47页，共53页，2023年，2月20日，星期四

与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又