细胞工程-3讲第1节-动物人工繁殖R

地球不属于人类，而人类属于地球人类的干扰、环境破坏，使鸟类和哺乳类动物灭绝的速度提高了100～1000倍。20世纪有110个种和亚种的哺乳动物，以及139种和亚种的鸟类在地球上消失了。目前，世界上已有593种鸟、400多种兽、209种两栖爬行动物和20,000多种高等植物濒于灭绝。第一页，共94页。霸王龙(灭绝于6千5百万年前），陆地上的最大的食肉动物。气候突变论大陆漂移论性别比例失调论碰撞论地球化学论酸雨论第二页，共94页。1916年：新疆虎1893年：海南白臀叶猴1922年：中国犀牛1972年：台湾云豹我国濒临灭绝的动物：糜鹿（全世界3000头）、华南虎（50头）、雪豹（100-2000头）、扬子鳄（1500只）、白暨豚（100只）、大熊猫（1000只）、黑犀牛（3500头）、指猴（9只）、绒毛蛛猴（100只）、滇金丝猴（1000只）、野金丝猴（700只）、白眉长臂猴（70只）“长江女神”之称的白鳍豚

2006年12月6国科

学家组成的联合调

查组宣布，在中国

的长江中未发现白

鳍豚，可能已成为

被人类“灭绝”的

第一种鲸类动物。第三页，共94页。大熊猫是我国的国宝，是国家一级保护动物，系濒危物种。野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%的雌性大熊猫不孕。长期以来圈养大熊猫90%的雄性大熊猫不育。我国20世纪末实行了大熊猫人工繁殖计划。第四页，共94页。“水中大熊猫”？中华鲟是中国特有的古老珍稀鱼类和世界现存鱼类中最原始的种类之一，距今有一亿四千万年的历史，被誉为“活化石”具有溯河洄游的习性。每年7—8月，由黄海、东海溯江而上，到上游的宜宾一带产卵繁殖后代。路途长达3000余公里。幼体出生返回大海成长。成熟后再重返出生地产卵繁殖。中华鲟世世代代不忘故地，不惧艰险，代表了中华民族的传统美德和勇敢精神，成为中华民族的象征，被命名为中华鲟，也被誉为“爱国鲟”。但是已被列为国家一级保护动物。世界自然保护联盟(IUCN)也将其列为濒危物种。第五页，共94页。野生中华鲟产卵场分布在金沙江下游和长江上游的约600公里江段。葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线。1991年11月27日长江葛洲坝水利枢纽竣工。1919年，孙中山先生提出设想；1992年4月3日，七届全国人大第五次会议通过《关于兴建长江三峡工程的决议》；2006年5月20日，三峡大坝最后一方混凝土浇筑完毕。世界规模最大的混凝土大坝。宜昌成立了中华鲟研究所人工繁殖的幼鲟第六页，共94页。本讲主要内容：1-体外受精动物（试管动物、试管婴儿）——有性生殖2-核移植动物（克隆动物）——无性繁殖本讲关键问题：1-体外受精动物的培育：精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法2-核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活、胚胎分割、胚胎冷冻保存第七页，共94页。上节课预习思考题：体外受精动物与核移植动物相比各自有什么优缺点？第八页，共94页。第一节

体外受精动物第九页，共94页。一

定义体外受精(In

vitro

fertilization，IVF)是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物（test-tubeanimal），是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。人工授精的区别第十页，共94页。张明觉1908～1991。美籍生殖生物学家、育种学家和甾体避孕药的创始人之一。1933年毕业于清华大学心理系。1938年在剑桥大学主攻动物育种和体外受精。1941年获博士学位。1951年发现“精子获能”的生理现象，为哺乳类卵子体外受精成功奠定了理论基础。1959年首先报道兔卵的体外受精获得成功，从此结束了生殖生物学界几十年来对哺乳类卵子体外受精能否成功的争论。第十一页，共94页。世界上首批试管动物1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。第十二页，共94页。

二

优点（1）发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。（2）促进家畜改良的速度：繁殖能力的提高促进家畜改良速度，加速育种过程。（3）保存遗传资源：对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”，进行受精卵或胚胎的长期保存。例如：“世界山羊之王”波尔山羊体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350克，屠宰出肉率可达60%以上。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。第十三页，共94页。三知识回顾第十四页，共94页。动物的胚胎在64细胞以前为实心体，称为桑椹胚。继续分裂成由100多个细胞组成的早期胚泡。细胞团内部空隙扩大，成为充满液体的囊胚腔（Blastocele），此时的胚胎称为囊胚。囊胚的大小仍和受精卵相似，但细胞已经增殖到上千个。第十五页，共94页。四

试管动物培育流程（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养（2）体外受精（3）胚胎体外培养（4）胚胎移植(Embryo

transfer，ET)：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术（5）体内发育、出生第十六页，共94页。

1.精子的采集与体外获能处理采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。精子的顶起反应：遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。第十七页，共94页。体内获能雄性精液中含有“去能因子”（多是：糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力：主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。可以水解糖蛋白等“去能因子”。第十八页，共94页。体外获能精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能。用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能。目前多用化学成分明确的溶液培养获能。1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体（A23187溶液）。此外，雌激素、孕酮、催乳素和前列腺素及肽类生长因子如表皮生长因子(EGF)、受精促进肽(FPP)、白细胞介素(II)等对精子获能也有影响。第十九页，共94页。

2.卵子的回收与成熟培养(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。(2)从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。第二十页，共94页。卵母细胞体外成熟培养未成熟卵母细胞（初级卵母细胞、次级卵母细胞要经过成熟培养使卵细胞成熟。家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细胞生长因子。作为能量来源的物质主要是葡萄糖，氨基酸也可作为能源起作用。卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、pH、气相等进行控制。第二十一页，共94页。卵母细胞体外培养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200微升，每个微滴中一般放入10-40个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39℃、100%湿度、5%二氧化碳。成熟标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。第二十二页，共94页。3.试管动物的体外受精精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。第二十三页，共94页。共同培养：将成熟的卵母细胞和获能的精子共同培养一段时间完成体外受精。精子密度为1-9×106/ml，每10微升精液中放人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。第二十四页，共94页。辅助受精技术是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又称辅助受精技术为显微授精(microinsemination)。第二十五页，共94页。透明带修饰法：运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程。适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。第二十六页，共94页。透明带下注射法术：

用微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精。优点是对卵细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但也存在多精受精问题。卵桨内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入到卵细胞的细胞质内使卵子受精。这样可以避免多精受精问题。但是精子质量是重要问题。第二十七页，共94页。4.胚胎培养受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。目前人们还不能在体外模拟子宫内的环境供胚胎继续发育。通常情况下，移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。培养液中成分除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。第二十八页，共94页。

发育阻滞问题

体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞(Developmental

block)。发育阻滞是胚胎体外培养的一个主要障碍。造成胚胎发育阻滞的因素比较复杂，既有胚胎发育本身因素，也有培养环境的客观因素。体外培养条件与体内发育条件的差异，造成了胚胎发育被阻断。第二十九页，共94页。

5.胚胎移植将胚胎移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或子宫角）。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。这就是通常所说的“借腹怀胎”。第三十页，共94页。手术法:将同期化处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，将吸有胚胎的胚胎移植管（图6.2）插入穿刺孔，小心将胚胎输入。这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。非手术法:使用类似于人工授精的专用输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角内，注入胚胎。第三十一页，共94页。

6.体内发育、出生胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体酮，目前多采用注射法给予黄体酮。胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。如果确定妊娠，则改用hCG继续补充到怀孕10周。妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位。第三十二页，共94页。五

试管婴儿试管婴儿（Test-tube

baby）是指将卵子与精子取出在体外受精，培养发育成早期胚胎，再植回母体子宫内发育出生的婴儿,

也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。体外受精-联合胚胎移植技术(IVF-ET

)。第三十三页，共94页。

2013年3月10日我国首例试管婴儿诞生25周年1988年3月10日，体重3900克的“萌珠”在北医三院出生，是中国大陆第一个试管婴儿。郑萌珠

张丽珠第三十四页，共94页。2010年10月4日，2010年诺贝尔生理学或医学奖授予有“试管婴儿之父”之称的英国生理学家罗伯特·爱德华兹。以表彰他在体外受精技术领域做出的开创性贡献。在他的主持下，世界上首个试管婴儿路易丝·布朗于1978年诞生。2010年诺贝尔生理学或医学奖第三十五页，共94页。莱斯莉·布朗和约翰·布朗是英国一对不孕夫妇。1978年7月25日，他们的女儿世界首例试管婴儿路易斯·布朗在英国诞生。一个视频：体外受精婴儿geo/science/v/2009-08-30/151244.shtml第三十六页，共94页。第一代试管婴儿：主要特征是模拟体内受精过程，将精子与卵子通过共培养完成受精。1977年，爱德华兹（Edwards）和斯蒂普特(Steptoe)创造的试管婴儿为第一代试管婴儿。第二代试管婴儿：是指采用显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内受精培育的婴儿。由于使用的是非自然选择的精子进行受精，因此可能将遗传缺陷传给下一代，同时显微授精操作容易造成卵细胞损伤。第三代试管婴儿：经过种植前遗传学诊断培育出的试管婴儿被称为第三代试管婴儿。取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎。第三十七页，共94页。六动物性别控制所谓性别控制，就是通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。第三十八页，共94页。（一）性别决定机制多数动物的性别是由性染色体决定的。以人为例：XX——女；XY——男在人Y染色体短臂发现了一个单拷贝基因，称为Y染色体性别决定区基因（Sex

determining

region

Y

gene，SRY）Y染色体短臂上一段SRY基因决定人的性别：激发下游基因MLS的转录，引起缪氏体抑制和睾酮分泌，形成雄性组织。抑制或对抗ＤＳＳ(逆性别剂量敏感基因)基因产物，抑制卵巢发育。XX染色体缺少SRY基因，染色体上DSS位点基因转录促进卵巢发育，形成雌性。第三十九页，共94页。（二）性别控制途径1.受精前性别控制：选择X、Y精子。物理和化学上存在差异，例如：Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。(1)离心分离法：X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度较Y精子略大，因此可以采用离心分离。因为X、Y精子密度相差不大（0.007g/m3），分离困难，对仪器精度要求高。(2)电泳分离法：精子带负电荷，Y精子负电荷略小于X精子，因此在中性缓冲液中，X精子向阳极移动的速度较快。第四十页，共94页。（3）免疫学分离法Y精子上存在雄性特异性组织相容性抗原（H-Y抗原），利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原，以此分离X精子（H-Y抗原阴性）和Y精子（H-Y抗原阳性）。主要有免疫亲和柱层析法和免疫磁珠法。目前这个方法仅限于小规模实验研究，准确性较低。第四十一页，共94页。（4）流式细胞仪分离法将精子稀释并与荧光染料Hoechst

33342混合，这种染料可以定量地与DNA结合。精子通过检索仪时被激光束激发，由于X精子比Y精子含较多的DNA，X精子放射出较强的荧光信号，分辨X精子和Y精子。借助两块各自带正电或负电的偏斜板，把X或Y精子分别引导到2个收集管中。第四十二页，共94页。2.胚胎移植前性别控制在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目的，这是动物性别控制较为实用的方法。第四十三页，共94页。

（三）胚胎性别鉴定细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是Ｘ还是Ｙ来鉴定胚胎的性别。分子生物学方法：根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别，可以采用PCR或FISH等分子方法进行确定性别。免役学方法：H-Y抗原第四十四页，共94页。课后阅读文献：课本上补充读物1牛华峰，张振仓，张君慧。动物胚胎工程技术研究进展。畜牧兽医杂志，2005，24（6）：24-26第四十五页，共94页。视频学习网站体外受精30/151244.shtml试管婴儿试管婴儿制作流程第四十六页，共94页。第2节

核移植动物1896192019872006第四十七页，共94页。

2012年诺贝尔生理学或医学奖英国发育生物学家约翰·格登1933年10月2日生。英国发育生物学家。主要以在细胞核移植与克隆方面的先驱性研究而知名。第四十八页，共94页。1958年，约翰·格登在牛津大学成功做出了体细胞克隆蛙。他将一个青蛙卵细胞内未成熟的细胞核替换为成熟肠细胞的细胞核，发育成为一只正常的蝌蚪。“克隆”

早在20世纪初期就已经被提出，但最初仅用于植物研究上。直到1963年，这一词汇才首次被用在动物研究领域，正是为了描述格登的蛙类克隆成果。第四十九页，共94页。一

定义细胞核移植（Cell

nuclear

transfer）是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。主要包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。细胞核移植动物：是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到受体，发育出生的动物——克隆动物（核质杂种）。第五十页，共94页。1－1952年，Briggs和King成功地在豹蛙上获得了胚胎细胞核移植后代。2-

1958年，约翰·格登在牛津大学成功做出了体细胞克隆蛙。3－1980年，中国将鲫鱼胚胎细胞移入鲤鱼去核的未受精卵中实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。二

克隆动物的发展历史第五十一页，共94页。中国“克隆之父”——童第周卓越的实验胚胎学家，中国实验胚胎学的主要奠基人。提出了核质关系理论：不仅仅是细胞核来决定细胞质发育方向，细胞质也决定细胞核的命运，核与质之间有非常密切的关系。童鱼：鲫鱼卵的核酸注入了金鱼受精卵的细胞质内，在发育成长的320条幼鱼中，有106条由双尾变成了单尾，金鱼表现出鲫鱼的尾鳍性状。说明不只是细胞核控制生物的遗传性状，细胞质也起着非常重要的作用。第五十二页，共94页。童第周主持撰写的论文《鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合而成的核质杂种鱼》，以中英文发表在1980年第4期出版的《中国科学》上，论文报道了中国成功获得具有“发育全能性”克隆鱼的消息。这是世界上报道的第一例发育成熟的异种间的胚胎细胞克隆动物。1981年，中科院水生生物研究所将成年三倍体鲫鱼的肾脏细胞核移植到二倍体鲫鱼去核的卵子中，获得了三倍体的克隆鱼，并发育成成体，证明成年鱼的体细胞也可以去分化和再程序化，具有发育成个体的全能性。研究论文发表在1986年的《水生学报》上。第五十三页，共94页。4-1984年，丹麦科学家斯丁·维拉德森成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物。证明胚胎细胞具有全能性。5－1997年，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过核移植克隆了一只雌性小绵羊——多莉。这是第一个体细胞克隆动物。证明成熟的体细胞也具有全能性。第五十四页，共94页。体细胞克隆：是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。A-理论价值：高度分化的体细胞具有全能性B-实践意义：由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫）方面意义重大。可以用患者本人细胞培育出新组织。第五十五页，共94页。2000年猕猴"特拉"

2000年老鼠“库姆利纳”1998年母牛诺托和卡加20世纪60年代开始，科学家已经成功克隆20多种动物2001年2003年2005年史努比第五十六页，共94页。三

技术流程1-核供体细胞的准备2-受体细胞的去核3-细胞核移植、激活4-重组胚的培养与移植5-核移植后代的鉴定第五十七页，共94页。1核供体细胞获得与取核供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行1～5

天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0/G1

期）。采用细胞松弛素B（Cytochalasin

B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。第五十八页，共94页。2受体细胞去核（1）用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。（2）用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。（3）使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失。第五十九页，共94页。3

细胞核移植细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。前者是用微吸管吸取供体核后，直接注射进卵子细胞质。后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中。第六十页，共94页。在细胞核移植时，供体和受体细胞周期的影响非常重要。处于G0/G1

的细胞为二倍体，会凝集成单个染色单体，处于G2

期的4倍体核会凝集成双倍染色单体。处于活跃复制的核（S期）会形成典型的“粉末状”形态，会引起DNA损伤。研究发现将G1期双倍体核移入激活的MII期卵子中，因为细胞周期同步，获得了较高的重构胚发育几率。第六十一页，共94页。

4

重组胚激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息（例如成熟促进因子）所控制，使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而导致供核回复到初始状态，基因从头开始表达。但是目前对于供体核去除自身修饰、去分化并恢复全能性的机制还不太清楚。黑龙江畜牧兽医，2007,(12):20-22第六十二页，共94页。重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。（1）电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。（2）化学激活：常用的激活剂包括乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素等。第六十三页，共94页。5重组胚培养和移植激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。（1）体内培养：是将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑葚胚，然后进行胚胎移植。（2）体外培养：是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。第六十四页，共94页。6体细胞核移植后代的鉴定对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。第六十五页，共94页。多莉羊举例第六十六页，共94页。1-供核细胞获得与取核取一只6岁已妊娠到后期的白色的芬兰多特西母羊的乳腺组织，酶消化分解成单个细胞，将这些细胞平铺在新鲜的细胞营养层（滋养层）上培养7天，将这些细胞转移到却乏营养的培养基上培养传代，其培养基的胎牛血清浓度从10%下降至0.5%，这样使细胞停在休止期（G0）

。（传到7-9代时，供体细胞可停在休止期，此时细胞染色体为54个，是二倍体）。在倒置显微镜下，用显微吸管将核吸出。第六十七页，共94页。

2-卵母细胞收集与去核受体卵细胞来自于苏格兰黑绵养，在注射促性腺释放素(GnRH)28-33h时，收集卵细胞。在倒置显微镜的视野下用显微吸管刺入，吸取中期染色体和少量细胞质。去核后卵细胞放在无钙镁，但含有1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中复原，然后转移到37度无钙、但含有10%的胎牛血清的M2培养液中保存备用。第六十八页，共94页。3-细胞核融入卵细胞将核和已去核卵细胞放入同一培养皿中，在交变脉冲电压为3伏的电场中融合5分钟，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流电脉冲3次，将乳腺细胞核融入卵中形成一个含有新遗传物质的卵细胞，称之为重构胚。第六十九页，共94页。

4-重构胚的培养将重构胚种植在绵羊结扎的输卵管中培养，大约培养6天后，大多数胚胎发育到桑椹期或囊胚期（8－16个细胞）。再选择发育优良的重构胚移植到苏格兰黑绵羊的子宫中，每只受体母羊移植1-3个重构胚。第七十页，共94页。

5-妊娠监护妊娠60天时用超声波诊断妊娠。每两周进行一次全方位监护胎儿发育。分娩时由兽医外科医生助产。产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。第七十一页，共94页。四

试管婴儿、克隆人可能引起的伦理学、社会学问题第七十二页，共94页。1-试管婴儿可能会带来怎样的问题？2-动物可以无休止地被克隆吗？3-你是否同意生殖性克隆？无性生殖是否是人类的倒退？4-克隆人会带来哪些问题？讨论题第七十三页，共94页。试管婴儿的幸福生活2004年9月4日，路易斯与时年34岁的安保部门官员韦斯

利·姆林德喜结连理。婚礼由

Edwards

亲自主持。2010年成功产下儿子。路易丝的妹妹纳塔莉也是试管婴儿。纳塔莉1999年生下了女儿凯茜，成为了第一个生孩子的试管婴儿第七十四页，共94页。第七十五页，共94页。生殖细胞捐献代孕非法买卖卵子与精子人造多胎性别选择人造子宫人兽嵌合体克隆人：父子？兄弟？母亲？人的唯一性问题？犯罪问题第七十六页，共94页。人造子宫——妇女解放？1970年，女权主义者舒拉米斯·费尔斯通在其著作《性别辩证法》(The

Dialectic

of

Sex:

The

Case

for

FeministRevolution)中说，应该通过研制人造子宫将妇女从“在性和生育活动中备受专制的角色”中解放出来。第七十七页，共94页。动