南京林业大学大学生实践创新训练计划项目结题报告

南京林业大学定量核磁共振法涮定桃花米中树皮素项目名称:项目类型：大学生实践创新训练计划项目结题报告定量核磁共振法涮定桃花米中树皮素项目名称:项目类型：的含量口重点项目口一般项目口指导项目口校企合作基金项目,校级项目项目编号：2018NFUSPITP111申请者：万相勇学院：化学工程学院专t：生物工程指导教师：杨世龙I肺实聆师2020年4月28日南京林业大学教务处制项目名称定量核磁共振法测定槐花米中柳皮素的含量项目负责人姓名学号专业联系电话万相勇生物工程项目组成员姓名姓名学号专业联系电话赵锦漪生物工程徐雪晶生物工程肖明生物工程徐英杰生物工程项目类型校级指导教师姓名/职称杨世龙实验师一、项目研究计划及内容（概述项目研究方法、过程及结果等）槐花米是国槐干燥后的花蕾，含有大量的芦丁等黄酮类化合物，具有凉血止血，清肝泻火等功效，是一种重要的中药饮片。2015版《中国药典》规定，采用高效液相色谱法，槐花米中芦丁的含量不低于15%,这对槐花米的质量提出了更高的要求。但市场上槐花米质量参差不齐，需要进一步对芦丁含量进行测定才能判断产品的质量。虽然高效液相色谱法测量结果准确，灵敏度高，但是制样繁琐，需要配制各种溶液，绘制校准曲线，测量速度较慢，因此急需开发一种快速、便捷的测量方法。定量核磁（QNMR）法具有快速、精确、便捷等优点，越来越受到学者的重视，因此，本实验拟采用QNMR法测定槐花米中芦丁的含量。为方便测量，实验先从槐花米中提取芦丁，将芦丁水解，得到水解产物棚皮素，采用QNMR法测定榔皮素。实验通过测定榔皮素（图示1）的氢谱，对棚皮素的峰进行归属，选择合适的内标的化合物，通过优化采样时间、驰豫延迟时间、采样次数等参数，确定最佳实验条件，在最佳条件下，对样品中棚皮素的含量进行测定，从而建立棚皮素的含量的测定方法。图示1棚皮素的结构式1棚皮素的制备芦丁的提取称取槐花米20g,加入0.4%四硼酸钠水溶液400ml,加热，在搅拌下加石灰乳调pH8〜9。保持微沸40分钟，随时补充失去的水分和保持pH8〜9。趁热倾出上清夜，用细布过滤。残渣用以上方法再提取一次。合并滤液。滤液在60〜70℃用1：1盐酸调至pH值2〜3。充分搅动使沉淀析出。静置，用细布抽滤，沉淀用冷水洗涤，抽干，得芦丁粗品，80C烘干，称重。按芦丁与水1：200的比例将芦丁粗品悬浮于蒸僧水中，加热煮沸10分钟左右使芦丁全部溶解。趁热用滤纸抽滤除去不溶物。滤液冷却后充分搅动使芦丁沉淀析出。静置，用倾泻法除去上清液再用滤纸抽滤除去母液，沉淀用冷水洗涤，抽干，于60〜70℃于燥，得精制芦丁，称重。芦丁的水解和柳皮素的制备称取精制芦丁1g放入烧瓶中，加2%硫酸50mL,微沸回流40分钟（开始加热10分钟，为澄清溶液，继续加热时逐渐析出细小黄色针状结晶，即榔皮素），至析出的鲜黄色沉淀不再增加为止，冷却，抽滤。沉淀用冷水洗涤，抽干，得棚皮素。2QNMR方法的建立QNMR的原理QNMR定量的原理主要是质子峰面积与其数目成正比。常用的定量方法有相对定量法、绝对定量法、内标法、外标法、标准添加法等，而应用最多的是内标法，内标法是采用结构已知、含量一定的化合物作为内标物，与待测样品配成混合溶液，同时测量，通过定量峰的面积比，计算待测样品的含量，计算公式如下:samAsamNstdMsammstdAstdNsam^-std^samPstdsamAsamNstdMsammstdAstdNsam^-std^samPstd(公式1)式中，Psam和Pstd分别代表样品和内标物的纯度，Asam和Astd分别代表样品和内标物中定量峰的峰面积，Nsam和Nstd分别代表样品和内标物定量峰对应的氢原子个数，Msam和Mstd样品和内标物的摩尔质量，Hlsam和mstd分别代表样品和内标物的质量。笊代试剂的选择与棚皮素的氢谱常用的笊代试剂有笊代甲醇，重水，笊代氯仿，笊代二甲基亚飒(DMS0-d6),气代乙月青等，用于QNMR的笊代试剂应具备不易挥发，不与样品反应，对样品溶解性好等特点，因此，实验选择DMS0-d6作为溶剂。棚皮素在DMSO-d6中的氢谱如图1所示,峰的归属下：NMR(DMSO-d6600MHz):12.50(s/H,5-OH),10.78(s/H,7-OH),9.59(s/H,3-OH),9.36(s/H,4'-OH),9.30(s/H,3'-OH),7.68(d,J=1.8Hz,1H,2'-H),7.54(dxd,JI=10.8Hz,J2=1.8Hz,1H,6'-H),6.90(d,J=8.4Hz,1H,5'-H),6.41(d,J=2.4Hz,1H,8-H),6.20(d,J=1.8Hz,1H,6-H)。图1棚皮素的氢谱图定量峰与内标物的选择样品定量峰的选择主要遵循以下规则：定量峰与其它峰分离度好，易于识别,定量峰最好为单峰，定量峰对应的质子最好为非活泼氢，性质稳定，定量峰与内标峰对应的质子尽量在结构上相似，化学位移相近，以减小误差，提高准确度。内标物的选择将对实验结果会产生很大影响，合适的内标应满足以下要求：不与待测样品和溶剂发生反应，可与待测样品混溶、定量峰不与待测样品信号峰重叠,摩尔质量最好与待测样品的接近，具有合适的T1值，自身性质稳定，不吸潮，不变质，纯度高，品质好，可长期保存，无毒，价格低廉。常用的内标物有慈、四甲基硅烷、马来酸、苯甲酸等。考虑的实际情况，本实验选择柳皮素在7.68ppm处的峰为定量峰，由于马来酸在6.26ppm处有单峰，可以用来定量，因此，内标选择马来酸，选择榔皮素7.68ppm处，马来酸6.26ppm处的峰为定量峰。实验条件优化由内标法计算公式可以看出，在内标物确定、称量准确的情况下，影响计算结果的主要因素是峰面积，而影响峰面积的因素主要来自仪器，因此仪器参数的显得十分重要。需要优化的参数有脉冲程序、谱宽、中心频率、采样时间、采样点数、扫描次数、接收器增益、驰豫延迟时间等。其中弛豫延迟时间、采样时间、扫描次数等的选择对实验结果有较大影响。实验采用90度脉冲程序，通过测定Asam与Astd比值，当比值基本稳定时，此时的弛豫延迟时间、采样时间、扫描次数等为最佳值，最终确定，驰豫时间为20s,采样时间4s,扫描次数为64次。含量测定精密称取11.6mg马来酸（99.0%）和棚皮素样品60.4mg溶于5mLDMSO-d6中，备用。取0.5mL溶液转移到核磁管中，设置驰豫时间为20s,采样时间4s,扫描次数为64次，进行采样。根据公式（1）计算棚皮素的浓度，重复测量三次。同时以紫外显色法为对比，计算棚皮素的含量。结果如表1所示。表1棚皮素含量的测定次数QNMR法紫外显色法Asam/AstdNstd/NsamMsam/Mstdmstd/msam榔皮素含量平均值RSD棚皮素含量10.98322.6010.19297.2%20.98622.6010.19297.5%97.40.16%97.3%30.98522.6010.19297.4%%由表1可以看出，QNMR测量误差小，结果精密，测量结果与常用的紫外法相近，表明测量结果准确，表明QNMR可以用测量棚皮素的含量。3结论实验建立了QNMR法测量榭皮素的方法，实验以马来酸为内标物，选取棚皮素7.68ppm处的峰，马来酸6.26ppm处的峰为定量峰，驰豫时间为20s,采样时间4s,扫描次数为64次。结果显示，QNMR定量结果准确，可以对棚皮素的含量进行测定，可以用来对槐花米中棚皮素和芦丁的含量进行定量，为槐花米的质量鉴定提供一种新的测定技术。二、项目完成情况1、主要研究成果及创新之处实验建立了QNMR法测量棚皮素的方法，可以用来对槐花米中棚皮素和芦丁的含量进行定量，为槐花米的质量鉴定提供一种新的测定技术。2、成果取得形式（发表论文、申请专利或竞赛获奖等情况，报告书页尾附上佐证材料：如论文、专利证书，项目参赛获奖证书等等）已发表论文2篇。三、经费情况（经费来源、经费使用情况）论文版面费1750元，打印、复印、排版等费用240元，共使用1990元。四、项目结题总结（包括:预定计划执行情况，项目研究和实践情况，取得的主要成绩和收获，项目实施过程中存在的问题及改进项目研究的设想、建议等）实验建立了QNMR法测量棚皮素的方法，优化了实验条件，可以用来对槐花米中棚皮素和芦丁的含量进行定量，为槐花米的质量鉴定提供一种新的测试技术。实验按计划顺利完成，超额完成项目规定的任务。本次实践，不仅顺利完成项目目标，而且在此过程中，项目主持人和成员学到了许多新技能，对核磁操作有了深入了解，掌握了QNMR法,加强了科研精神训练，实验技能大大提高，受益匪浅。同时，在项目研究过程中也发现很多问题，例如对核磁接触还是太少，发现核磁用途很广，有待进一步开发，希望核磁能