细胞生物反应器制药课件

第三章细胞工程制药

—转基因动物与生物反应器2第一节转基因动物

转基因动物是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系microinjection

受精卵准备胚胎操作过程显微注射假孕母鼠准备(养母)

胚胎移植TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblotPhenotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+micePalmiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超级小鼠其它功能基因---基础研究中一直使用Hammeretal,1985,Nature(rabbit,sheep,pig)GH为主，开始关注转基因动物的病理变化第二阶段：转基因小鼠模型及快速生长家畜TMtransgenemiceDenningetal2001,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,2002,Science(GT-outpig)GT:半乳糖转移酶第三阶段：异种器官移植(pig)和乳腺反应器外源基因导入动物细胞的方法：

转基因动物的制备：核心技是如何把目的基因转入动物早期胚胎细胞中原核期胚胎显微注射法反转录病毒感染法胚胎干细胞法精子载体法人工酵母染色体法受精前卵细胞显微注射法通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大雄性原核内将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达2023/4/7细胞工程132023/4/7细胞工程141.可靠性高、重复性好2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.导入DNA片段的大小和类型不受限制4.转基因在代与代之间传递的稳定性好5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响6.可能会出现不希望的插入突变7.开发装置和技术的花费大时间长2023/4/7细胞工程15显微注射法获得转基因鼠的成活率

反转录病毒感染法：

利用反转录病毒LTRs（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组，再包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。转录启动子2023/4/7细胞工程18

缺点：低拷贝数需要逆转录病毒插入DNA大小有限可能产生不希望的重组高频的镶嵌现象逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达

胚胎干细胞介导法：将目的基因转移入ES，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因ES进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较晚。从猪胚胎中获得了干细胞克隆系1988，牛的胚胎干细胞1990。建立大家畜ES细胞系仍很困难，但随着一些相关关键技术的成熟，ES细胞介导法将会在转基因动物的研究中起到更加重要的作用受精前卵细胞显微注射法

Anthony等（1999）尝试一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GFP报告分子的外源DNA短时间（1min）共孵育，然后徽注射入减数分裂II期的卵母细胞质中，取得64%～94%转基因表达胚胎。将转GFP的胚胎移植，20%的后代表现为基因整合。此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后，外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源DNA能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞，经膜处理的携外源DNA精子的徽注射是一种有效的转基因手段。2023/4/7细胞工程22四种方法比较方法显微注射胚胎干细胞逆转录病毒精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb外源DNA的整合率高；

整合在生殖细胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在动物各种组织中的分布不均有些结果不能重复

酵母人工染色体(YAC)载体是近年发展起来的新型载体,它能克隆百万对碱基的大片段DNA。作为制作转基因动物载体具有以下优点：A.

保证大片段DNA的完整性B.

提高较长外源片段在动物转基因时的整合率C.

保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应.因此，YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景

酵母人工染色体(YAC)法※医药领域的应用

a.抗出血药物

b.抗凝血药物

c.血栓治疗药物

d.肺气肿治疗药物

e.免疫治疗药物

f.人型化单克隆抗体荷兰：GenPharm公司用转基因牛生产EPO，产值40亿美元英国：生产1-抗胰蛋白酶制剂（治疗肺气肿病）的转基因羊,一升羊奶6000美元1999年，只有三种产品进入临床实验；到2009年，已经有70多种进入临床实验或即将进入市场。

应用转基因动物/乳腺生物反应器生产药用蛋白是药物生产的一种全新模式，具有投资成本低、药物开发周期短和经济效益高等优点，将成为21世纪最具有巨额经济利润的新型医药产业。

表达载体的构建

制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，外源基因在乳腺表达需要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列。传统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作为启动子元件。这些基因的调控区主要包括启动子区、增强子序列和其他众多转录、翻译相关元件。

目前用于表达载体的启动子调控元件主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。

2023/4/7细胞工程30

目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因有：

β-乳球蛋白(BLG)基因、αSl-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)及乳清白蛋白基因。反刍动物一般采用牛的β-乳球蛋白（BLG）基因，该基因非常稳定，并能在乳腺中特异性表达；家兔、猪和鼠类则采用乳清酸蛋白WAP

抗凝血药物：抗凝血酶Ⅲ

第一个进入临床试验的转基因蛋白产物。将半乳糖β-酪蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊的乳液中得到有生物活性抗凝血酶Ⅲ蛋白，产量可达7g/L。2006年6月2日上市。治疗先天性抗凝血酶缺失症病，我国2008年11月首次用乳腺生物反应器获得抗凝血酶Ⅲ蛋白纯品

α1-抗胰蛋白酶:

抑制肺气肿释放的蛋白酶对肺组织的破坏.

是一个利用BLG基因构建的重组蛋白。将BLG5末端4.0kb序列与人的α1-抗胰蛋白酶（α1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一个内含子）融合，再连接羊的BLG启动子，以pPOLYⅢ-Ⅰ为载体，转入羊的胚胎细胞，可在转基因羊分泌的乳液中得到含量高达60.0mg/ml的重组蛋白α1AT。

从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA）。红细胞生成素（EPO）

目前国内外均采用CHO细胞表达生产人EPO，成本比较昂贵，而用转基因动物生产的EPO，可能是一条理想的途径。将EPODNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收5.4kb的HinⅢ/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将867bp的β-乳球蛋白（BLG）启动子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射方法得到转基因小鼠乳汁中的EPO含量可达0.5μg/ml。问题及展望

目前，生产实践中动物乳腺生物反应器的应用已崭露头角，但这项技术还存在着众多问题，※研发周期长、前期投资大及技术难度高等，导致所有产品都未商品化；※有关转基因动物的基础理论研究还比较薄弱；※乳腺生物反应器的异位表达和表达产物的泄露问题也需要各种新技术来解决；※人们对转基因产品安全性以及转基因技术所涉及的伦理道德问题的考虑，对转基因产品接受程度不高。应用转基因植物生产的药物不同转基因生物反应器的特点比较第三节在异种器官移植中的应用

人体器官的最佳替补无论体积大小，还是外观形状，甚至结构功能，与人体器官最相似的应属猪的器官。因此，猪被视为异体器官移植的理想“替补”。移植难题

猪体内存在两个α-1，3－半乳糖转移酶(GT)基因)，“GT”基因控制半乳糖基转移酶的产生，这种酶使猪细胞表面形成一种标记性的多糖。当猪器官或细胞被移植给人体时，人类免疫系统能识别这种糖，从而产生强烈的排异反应，把移植的器官或细胞视作外来异物进行攻击。使器官在数小时之内死亡。

解决方案

目前，科学家已经敲除了转基因克隆猪体内的一个“