基因工程的工具酶优秀公开课

第三章基因工程的工具酶第一节基因工程的工具酶第二节DNA的切割反应第一节基因工程的工具酶一、限制性内切酶（Endonucleosase）二、T4-DNA连接酶（T4-DNALigase）三、核酸酶四、聚合酶五、DNA修饰酶

一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase）（一）限制性内切酶的发现与分类1）限制－修饰系统：细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰。（二）II类限制性内切酶的命名及特性命名原则HaemophilusInfluenzued嗜血流感杆菌d株属名种名株名HindIIIHindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点

几种最常用的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamHⅠ

ClaⅠEcoRⅠHindⅢHindⅡKpnⅠNotⅠPstⅠSalⅠSau3AⅠSfiⅠSmaⅠXbaⅠXhoⅠG↓GATCC

AT↓CGATG↓AATTCA↓AGCTTGTPy↓PuACGGTAC↓CGC↓GGCCGCCTGCA↓GG↓TCGAC↓GATCGGCCNNNN↓NGGCCCCC↓GGGT↓CTAGAC↓TCGAG二、T4-DNA连接酶（T4-DNALigase）来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键。（一）Bal31(来自于细菌Alteromonasespejiana)单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+

用途：

构建限制酶图谱

产生末端缺失突变

DNA超螺旋线性化

（二）E.coli外切酶III

只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）

特性：

1.降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度

2.降解发生的方式为内切

3.酶切活性需4.0-4.5pH环境，Zn2+激活

4.酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍

（二）Klenow酶该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性及3‘-5’外切活性。基因工程中利用该酶：

修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端

标记DNA探针

催化cDNA第二条链的合成

末端终止法测序

3’5’GA新链合成方向5’C（三）T4DNA聚合酶

（四）T7DNA聚合酶

测序酶

（五）TaqDNA聚合酶

耐高温，主要用于PCR反应

DNA聚合酶活性

RNaseH活性

DNA内切酶活性

核酸结合活性（六）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTTT

3’cDNA3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP反转录酶的基本特性：（RNaseH）双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链5’3’RNA3’5’DNA

5’3’RNA3’5’DNA3’5’DNA反转录酶反转录酶五、DNA修饰酶有大量的修饰酶，主要的有以下几种：1）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。

2）polynucleotidekinase:来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。

5‘3‘3‘5‘

ppOHHO3）末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。5’3’3’5’ATGCATAGCADNA重组技术中最常用的工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3’凹端④DNA序列分析TaqDNA聚合酶聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3’末端加入同质多聚物尾SI核酸酶，绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶Ⅰ降解DNA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解除RNA磷酸酶切除核酸末端磷酸基第二节DNA的切割反应一、缓冲系统的组成二、酶切操作三、酶切结果分析四、多酶联合酶解五、定位酶切位点六、限制性内切酶的star活性一、缓冲系统的组成II类酶的酶活条件：Tris-HClpH7.5,25-50mM；10mMMgCl2；NaCl0-150mM；DTT1mM

根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下三种情况：

高盐：100-150mM

中盐：50-100mM

低盐：0-50mM二、酶切操作DNA量的确定，加入酶量的确定，反应体积的确定（20μl），反应时间的确定，1-1.5hr，一般为37℃，但也有例外，如TaqI在65°C时活性最高。

单位限制性内切酶定义为：在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时，完全水解1μgDNA所需的酶量。

三、酶切结果分析（一）酶切片段的检测1）通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。2）DNA分子的检测

a.染色EB，DNA分子小于25ng，很难检测到。

b.放射性自显影,可以监测少到2ngDNA分子。（二）估计DNA分子的大小

根据DNA分子的迁移率，可以用公式计算出分子量D=a–b(logM)

D是移动的距离，M是分子量，a,b是恒量但随着电泳条件的改变而改变。

也可根据已知大小的片段进行比较，误差约在5%左右。四、多酶联合酶解对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时