转录优秀课件

第三章生物信息的传递(上)-----从DNA到RNA目录第一节RNA的转录第二节启动子与转录起始第三节原核生物与真核生物mRNA的特征比较第四节终止和抗终止第五节内含子的剪接、编辑及化学修饰

前言1957年Crick提出了中心法测(centraldogma)

DNA→RNA→蛋白质

1970Crick又作了部分修改：

DNARNA蛋白质基因表达包括转录和翻译两个阶段。转录：指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程。1963J.Marmur和DotySpiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料。编码链（有意义链）：与mRNA序列相同的那条DNA链模板链（反义链）：根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链模板链与非模板链第一节RNA的转录一、转录的基本过程二、转录机器的主要成分一、转录的基本过程无论真核还是原核，其转录的基本过程都包括：模板识别转录起始通过启动子转录的延伸和终止转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功的合成9个以上的核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断深长的过程就是转录的延伸。当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。

真核生物转录的基本模式是辅助因子与酶结合，识别启动子，酶进行转录。细菌中是RNA聚合酶识别启动子。怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5-3′方向进行的？E.coli在0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸;利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli，。提取这种正在伸长的mRNA分子发现14C标记首先出现在伸长的3′端，因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。RNApol执行多功能(1)识别DNA双链上的启动子；(2)使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3)通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链。(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。原核生物的RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶研究发现，由β和β′亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。Β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。核心酶具有的四个功能位点

ααβ’β★DNA/RNA杂交位点(β)

★D.S.DNA解链位点(α)

★D.S.DNA重旋(α)

★启动子识别位点

σ★DNA无义链结合位点(β’)

大肠杆菌中的σ因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合因子基因功能-35区间隔（bp）-10区σ70rpoD广泛TTGACA16-18TATAATσ32rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54rpoN氮代谢CTGGNA6TTGCA转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生RNA的5‘端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在σ因子的释放α-鹅膏蕈碱的抑制作用RNA聚合酶I：不抑制RNA聚合酶II：抑制RNA聚合酶III：反应不一（二）转录复合物转录可被分为4个阶段，即启动子的选择、转录起始、RNA链的延伸和终止。除了RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与。蛋白质亚基数亚基的相对分子质量/103功能RNA聚合酶Ⅱ1210~220催化RNA的生物合成TBP138与启动子上的TATA区相结合TFⅡA312，19，35使TBP及TFⅡB与启动子的结合比较稳定TFⅡB135与TBP相结合，吸引RNA聚合酶和TFⅡF到启动区上TFⅡD1215~250与各种调控因子相互作用TFⅡE234，57吸引TFⅡH，有ATP酶及解链酶活性TFⅡF230，74结合RNA聚合酶Ⅱ并在TFⅡB帮助下组织聚合酶与非特异性DNA序列相结合TFⅡH1235~89在启动子区解开DNA双链，使RNA聚合酶Ⅱ磷酸化，接纳核苷酸切除修复体系

转录因子转录复合体TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的转录起始第二节启动子与转录起始大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括：启动子区的识别酶与启动子的结合σ因子的结合与解离。转录单元（transcriptionunit）：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证明通常为一个嘌呤。上游：把起点前面，即5‘末端的序列下游：其后面即3‘末端的序列一.启动子区的基本结构启动子是一段位于结构基因5‘端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的相结合并具有转录起始的特异性。原核启动子RNA聚合酶结合区，此区域在转录起始位点附近。RNA聚合酶结合到起始点紧邻的上游，然后滑动到起始点。

真核启动子DNA上的一个区域，其中含有可用通常效率和适当调控下支持转录的结合位点。RNA聚合酶通过转录因子结合于起始点附近。原核生物一个经典的原核生物启动子主要由4个区域组成：-35序列、-10序列、转录起点、-10序列和-35序列间的距离。-35序列为RNA聚合酶σ因子的识别位点。RNA聚合酶与该位置接触在启动子区域形成封闭复合物。-10序列为RNA聚合酶牢固结合位置并在此解链，形成开放起始复合物。典型启动子的结构

-35

-10

转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp1.-10序列：-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。保守序列为T80A95T45A60A50T9位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。其功能是:(1)RNApol紧密结合;(2)形成开放启动复合体；

(3)使RNApol定向转录。-10序列对转录的效率影响TATAAT→AATAAT，转录效率下降,称为下降突变（downmutation）。TATGTT→TATATT，转录效率上升，为上升突变（upmutation）。以上突变为何会影响转录效率？前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少，2.-35序列-35序列又称为Sextama盒（Sextamabox），其保守序列为（T82T84G78A65C54A45）其功能是:(1)为RNApol的识别位点。

σ亚基识别-35序列，为转录选择模板(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNApol的结构有关。真核生物真核生物细胞中有三种转录方式，分别由三种RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ催化，因此由三种启动子。根据启动子的不同，将真核生物的基因分为三类，即Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。这三种基因分别由三种启动子控制，它们在结构上各有特点。RNA聚合酶Ⅰ其启动子间的差异最小，因为其只转录rRNA基因。人的RNA聚合酶Ⅰ的启动子主要由两部分组成：核心启动子足以使转录起始，上游调控元件（upstreamcontrolelement,UCE）,可以大大地提高核心启动子的转录起始效率。RNA聚合酶Ⅱ其主要负责蛋白质基因和部分核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)的转录，其启动子结构最为复杂。RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子由转录起点、TATAbox和CAATbox以及上游启动子成分，如增强子等组成。有些只含有核心启动子中两个成分之一，有些则无核心启动子。这些缺失核心启动子的基因仍可转录。RNA聚合酶II启动子上游元件upstreamelementTATAbox(TATAAAA)位于-25~-35bpCAATbox(GGCCAATCT)，位于-75bpGCbox(GGGCGG)，位于-90bpoctamer(an8bpelement).上游启动子元件（UPE）表12-4哺乳动物RNAPolⅡ上游转录因子结合的元

元件 保守序列 结合DNA的长度蛋白质因子TATAbox TATAAAA ～10bp TBP CAATbox GGCCAATCT ～22bp CTF/NF1GCbox GGGCGG ～20bp SP1 Octamer ATTTGCAT ～20bp Oct-1Octamer ATTTGCAT 23bp Oct-2KB GGGACTTTCC ～10bp NFKB ATF GTGACGT ～20bp ATF B.Lewin:《GENES》Ⅵ.1997,Table28.2RNA聚合酶Ⅲ其产物为一些分子量较小的细胞质RNA，包括tRNA,5srRNA,U6RNA等。包括三种类型：位于基因内部，没有TATA盒框，有内部转录控制区(internalcontrolregion,ICR)组成，如5sRNA基因；位于基因上游，有两个基本成分PSE(proximalsequenceelement,近端顺序元件)和TATA盒框，如U6RNA基因；混合启动子，即含有如5srRNA基因的内控区，又有如U6RNA基因的上游启动子。二.启动子区的识别RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。由含70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子大肠杆菌中部分启动子上的一致顺序三.酶与启动子区的结合1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinarycomplex）；3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；4.酶移动到I，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。延伸核心酶负责RNA的延伸RNA延伸方向5’→

3’RNA转录延伸期转录泡模型RNA链延伸的两种可能模式RNA链的延伸RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:(1)σ和1/3的RNApol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中；(2)其中半数的核心酶从事转录；(3)余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中；(4)估计数量很少的全酶是游离的。四.-10区和-35区的最佳距离在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。五.增强子Enhancer及其功能增强子是与转录起始有关的位点，具有增强转录起始的作用相对于启动子来说，增强子的位置不是固定的，变化很大增强子可在两个方向上起作用其特点是：①具有远距离效应。②无方向性。③顺式调节。④无物种和基因的特异性。⑤具有组织的特异性。⑥有相位性。其作用和DNA的构象有关。⑦有的增强子可以对外部信号产生反应。六.真核生物启动子对转录的影响TATA区主要作用是使转录精确的起始，如果除去或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。CAAT区对转录起始频率的影响最大。真核细胞中存在着大量不同的转录调控因子。基因转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子各种调控元件相互作用的结果。第三节原核生物与真核生物mRNA的特征比较一、原核生物mRNA的特征原核生物mRNA的半衰期短许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在原核生物mRNA的5‘端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)结构4.原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区，其与16SrRNA3‘端反向互补。几乎所有mRNA都可以被分成3部分：编码区、位于AUG之前的5‘端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3’端下游非编码区。二.真核生物mRNA的特征1.真核生物mRNA的5‘端存在“帽子”结构帽子结构是GTP和原mRNA5‘三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物，新加上的G与mRNA链上所有其他核苷酸方向正好相反，像一顶帽子倒扣在mRNA链上，故而得名。三种帽结构mRNA5’端帽结构形成过程2、绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴几乎所有真核基因的3‘末端转录终止位点上游15~30bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加poly(A)是必需的。加poly（A）时需要由内切酶切开mRNA3‘端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催化多聚腺苷酸的反应。加Poly(A)的反应第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。第四节.终止和抗终止RNA聚合酶启始基因转录后，它就会沿着模板5‘→3’方向不停的移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，模板DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。研究RNA链终止时遇到最常见的问题是3‘端核苷酸的定位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的RNA与一个经过剪接的RNA在3’端没有两样，都是-OH基团，而研究5‘时，只有初生RNA上才有一个三磷酸基团，任何经过剪接修饰的5’端不再带有这个基团。一、不需ρ因子的终止终止子结构终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4~8个A组成的序列，所以转录产物的3‘端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5'端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3'端部分出现不稳定的rU·dA区域。终止子结构不依赖Rho因子的转录终止二、需ρ因子的终止ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。有人认为，在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5'→3'方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3'-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子具有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。三、抗终止破坏终止位点RNA的茎-环结构依赖于蛋白质因子的转录抗终止第五节、内含子的剪接、编辑及化学修饰一、RNA中的内含子真核基因表达往往伴随着RNA的剪接过程，从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA.RNA加工过程及其生理过程加工过程推测的生理功能加帽子反应mRNA从细胞核向细胞质运转，翻译起始加poly(A)反应转录终止，翻译起始和mRNA降解RNA的剪接从mRNA，tRNA和rRNA分子中切除内含子RNA的切割从前体RNA中释放成熟tRNA和rRNA分子内含子类型细胞内定位GU-AG细胞核，前mRNA（真核）AU-AC细胞核，前mRNA（真核）Ⅰ类内含子细胞核，前rRNA（真核），细胞器RNA，少数细菌RNAⅡ类内含子细胞器RNA，部分细菌RNAⅢ类内含子细胞器RNA双内含子细胞器RNAtRNA前体中的内含子细胞核，tRNA前体（真核）生物体内的各种内含子核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫rRNA时发现的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”；是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。和传统酶的区别：(1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应。核酶发现的意义（1）突破了酶的概念.是一种自体催化；（2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。（3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。二、RNA的剪接剪接位点是通用的，对任一单一的RNA来说无特异性，任一前体对剪接也不提供特异的信息。剪接装置也是通用的，无组织特异性，一个RNA可在任何细胞中剪接，不管这个RNA是否是在这个细胞中合成的。GT-AG规则剪接位点序列高度保守，只存在于内