基因工程的基本操作程序公开课课件

1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1目的基因主要是指编码蛋白质的基因如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制目的：大量获得目的基因多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR扩增仪模板DNA95℃PCR扩增过程PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物272℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR技术的操作过程a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板受热变性，_____断裂，形成________b、复性（退火）（55℃-60℃）：系统温度降低，_____与DNA模板结合，形成局部DNA双链。c、延伸（70℃-75℃）：在_____的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNADNA链引物Taq酶重复循环a-c过程，每一次循环后目的基因可以增加____倍，也就是成________形式扩增。一指数3.利用DNA合成仪人工合成前提：基因比较小、核苷酸序列已知DNA合成仪表达载体的组成启动子：终止子：标记基因：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（基因表达载体）同一种一个切口两个黏性末端

三、将目的基因导入受体细胞转化:目的基因进入_____

____内，并且在受体细胞内维持_

___和___

__的过程受体细胞稳定表达三、目的基因导入受体细胞③过程：Ti质粒目的基因表达载体构建转入农杆菌导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法

①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

②

常用金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。

③适用：单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法

①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞

②

特点:十分简便经济。

③例子：转基因抗虫棉显微注射法（最常用，最有效）（3）将目的基因导入动物细胞方法——受体细胞——受精卵目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物过程：2、将目的基因导入动物细胞（2）将目的基因导入微生物细胞过程：Ca2+处理受体细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。大肠杆菌最常用。方法——用Ca2+处理细胞细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。3、将目的基因导入微生物细胞1、检测——分子水平的检测方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针转基因生物的mRNA1、检测——分子水平的检测提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养1、检测——分子水平的检测（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交将抗原-抗体相杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验活性比较实验

例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。1、将目的基因导入受体细胞时，根据受体细胞的不同，选用的方法不同，若导入的是植物细胞，则常用____________，若导入的对象是动物，则用______作为受体细胞，然后用________,若导入的是微生物细胞，则用____________。2、基因工程是否成功，我们还要进行最后的检测和鉴定。检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因应采用_____________，检测目的基因是否转录出了mRNA应采用___________，检测目的基因是否翻译成蛋白质，应进行____________。