分子生物学试验讲义总

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试验一：对虾（肌肉组织）基因组DNA的提取

（下次上课时交这次课的试验报告，依此类推）一、试验目的：

把握提取动物基因组DNA的基本方法，基因组DNA的提取寻常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分开基因等。

二、试验原理：

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分开。参与一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团悬浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发活力械断裂，产生大小不同的片段，因此分开基因组DNA时应尽量在温柔的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必需在100kb以上，否则酶切后两边都带适合末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分开方法也有差异。在提取某种特别组织的DNA时必需参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。特别是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

本试验以对虾幼虾肌肉组织为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。

三、试验材料、试剂和仪器：

1.试验材料：-80℃保存的南美白对虾幼虾；（在116的超低温冰箱里，橘色盖子的冻存管中，可让研究生提前找好，每个冻存管中有2~3尾幼虾，学生做试验时，每个两人的小组取1/2或1/3尾幼虾进行研磨即可。）

2.试验所需试剂：CTAB提取缓冲液、Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿-异戊醇（24:1）、RNaseA、无水乙醇、75%乙醇、ddH2O（或TE）；（这3个标红色的试剂以

前没用过，只用的是氯仿，RNaseA也没用过，所以提取效果很不好，所以最好让冯欣把这三个试剂赶快订上）

3.试验所需仪器及器皿：研钵、微量移液器、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、1.5mL离心管。

四、操作步骤：

1.称取约0.2g对虾组织置于研钵中（研钵在上课前放入超低温冰箱中预冷），参与700μLCTAB提取缓冲液，在冰上充分研磨成匀浆后转入1.5mL离心管中；

2.65℃水浴加热20min，中间适当轻轻摇动；（4楼试验室的水浴锅很大，加热缓慢，去试验室后先开启水浴锅和制冰机，再开始讲课）

3.（因时间关系，这个步骤可以选做）如要除去其中的RNA，可加5μLRNaseA(10μg/μL)，37℃保温30分钟；

4.参与等体积（700μL）Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），轻轻振荡约10min，使两者混合均匀，4℃，9000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中；

5.参与等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻振荡混匀，4℃，10000rpm离心5min，取约400μL上清转移到一个新离心管中；

6.参与约2.5倍体积（1mL）预冷的无水乙醇（无水乙醇在上课前放到超低温冰箱中），轻轻混匀，可见白色絮状DNA，-80℃沉淀约20min；7.4℃，10000rpm离心5min，弃上清；

8.用75%乙醇洗涤一次，4℃，10000rpm离心5min，弃上清；9.空气枯燥5~10min；

10.参与50μL灭菌的ddH2O（或pH8.0的TE）溶解DNA，-20℃保存，取2μL进行电泳检测。（电泳检测由研究生代为完成，下次课前给学生看结果）

五、试验结果：

1.参与预冷的乙醇后，可见核酸形成白色的絮状沉淀，离心后白色沉淀位于管底部，记录溶解状态和难易度，假使难于溶解，说明混有蛋白；

2.记录电泳后的条带结果。基因组DNA分子较大，经过枪头吹打后被打断成约20~40kb左右的片段，在电泳过程中迁移慢，移动距离较小；而RNA则大部分被降解，分子较小，迁移距离较大，跑在前方。

六、分析与探讨：

1.DNA的条带假使较弱，可能是由于部分降解所至。降解原因可能是由于对虾样本放置时间较长所至，也可能是研磨时参与的样本太多所至，导致研磨不充分，DNA没有充分释放出来。参与预冷的无水乙醇后再-80℃条件下沉淀时间较短，也可能导致DNA沉淀不充分。

2.用酚仿抽提比用氯仿抽提效果好些，能很好的溶解脂类和蛋白质。

3.在低温条件下研磨对虾，可保持DNA结构的稳定性，减少对DNA的破坏，酚仿既可以充当有机溶剂，溶解脂类和蛋白质，又可蛋白变性剂，是蛋白变性，与DNA分开。

试验二：PCR扩增目的基因（扩增河蟹高血糖激素基因CHH）

一、试验目的：

1.学习把握PCR扩增的原理；2.把握PCR试验的操作过程；

3.通过PCR扩增获得河蟹高血糖激素基因（CHH）的部分cDNA片段。

二、试验原理：

1.PCR技术是KaryMullis在1985年建立起来的在体外合成DNA的一种方法；（见下图）

2.PCR是依据DNA半保存复制原理，利用DNA聚合酶依靠于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段。该过程包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5’端限定的特异性片段形成指数式积累，在短时间内可获得大量特异的DNA拷贝；

3.扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环分3步：

（1）模板变性：加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离于溶液中的单链DNA；（2）引物退火：温度突然降低，反应体系中的引物能确凿地配对于被扩增区域的两个侧翼，这是由于模板分子结构比引物的结构繁杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条链的重新结合；

（3）序列延伸：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核酸及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5’-3’DNA链延伸反应，n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝数为2n-1；

4.引物的设计必需有参考序列：可通过建立基因组文库或cDNA文库，进行测序获得参考序列；或纯化蛋白，对蛋白进行末端测序获得部分参考序列，进而设计兼并引物进行扩增；假使没有任何信息，也可通过同源克隆，根据已有相近物种的序列来设计引物；5.DNA变性要经过94℃的高温，DNA聚合酶最初来源于温泉中的一种耐高温的嗜热菌，现多为重组制品，不会在高温下变性失活；

6.模板cDNA为去除内含子后的mRNA在反转录酶（RNA依靠的DNA合成酶）的作用下形成的DNA。

三、试验材料、试剂和仪器：1.试验材料：

（1）扩增河蟹CHH基因所需的模板；（用含有CHH的菌液即可，让王艳华提前准备）（2）扩增所需序列特异性引物。（王艳华准备）2.试剂：

ddH2O、10×PCRbuffer(成分：Tris-HCl(pH8.3)100mM;KCl500mM;MgCl215mM）、dNTP（含dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM）、TaqDNApolymerase（Takara，在甘油中保存）3.仪器：

制冰机、微量移液器、PCR小管、PCR仪、台式离心机

四、试验步骤：1.PCR反应体系：

10×PCRbuffer(Mg2+plus)2.5uL

dNTP2uLTemplate1uLPrimer11uLPrimer21uLTaqDNApolymerase0.25uLddH2O17.25uL2.PCR反应条件：

94℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃1min；35个循环；72℃10min；15℃10min.3.加样顺序：先加ddH2O，然后依次将10×PCRbuffer、dNTP、Primer参与到水中，最终加模板和TaqDNApolymerase（这两样用时从冰箱中现用现拿）；

4.全部加完样品后在Vortex（涡旋振荡仪）上混匀样品，然后置于离心机（或者掌中宝）中快速离心，除去反应体系中的气泡，并使管壁上的液滴流下。5.放于PCR仪中进行PCR扩增。（简单讲解PCR仪的使用和本卷须知）

五、试验结果：

PCR扩增的结果需要用电泳检测，具体的电泳检测留到试验三进行。

六、分析探讨：

1.假使模板是基因组DNA，由于分子量较大，需要提前在95℃水浴中预变性10~15min，假使是cDNA为模板，由于其分子量较小，则不需要预变性；

2.PCR仪扩增时选择热盖，假使没有热盖功能，可在加完所有组分后滴加1~2滴矿物油，防止挥发；

3.严格的操作应在冰上进行，可防止非特异性扩增；

4.引物的母液浓度为10pmol/uL，在25uL反应体系中参与1uL后的工作浓度应在0.1~0.5pmol/uL范围内，引物量过大时，简单产生引物与模板的错配和形成引物二聚体；5.反应buffer中含有适量的Mg2+，它直接影响到引物的退火、模板和PCR产物的接连温度；

6.dNTP中4种脱氧核糖核酸的浓度应平衡相等，且不要较高，较高时反应过快，较低时，反应过慢；

7.Taq酶的浓度应适合，在100uL的反应体系中需要1~3个单位的酶，过多时可导致非特异性DNA的积累，会产生较强的背景。

试验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

一、试验目的：

1.把握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测原理和方法，能够利用电泳Marker估计DNA分子的大致大小；

2.检测试验二中各组PCR扩增后得到的目的基因的质量及大小。

二、试验原理：

1.琼脂糖是由β-D-吡喃型半乳糖和3,6-脱水-β-L-吡喃型半乳糖以糖苷键相互交替（1,3-1,4）连接而成的一种线性半乳糖，它能够在热的溶剂中熔化并在冷却过程中形成凝胶；

2.适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳的支持物，可以发挥分子筛的功能，使大小构型不同的核酸分子泳动距离出现较大差异，以达到分开的目的；

3.由于核酸分子结构的重复性，核苷酸数目一致的不同核酸几乎具有灯亮的静电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的影响，真正决定核酸分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素是核酸分子的大小和构型；DNA分子含有大量磷酸，带负电，在电场力的作用下会向正极移动，但由于其大小构型不同，导致迁移率不同，因此可以将它们分开；（电泳槽：红正黑负）

4.观测琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，因此被认为是一种潜在的致癌物。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料浮现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种状况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。

由于在该染料存在的状况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的确凿大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定）时，凝胶应当在无EB状况下电泳，电泳终止后用EB染色。染色完毕后，寻常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，寻常要将染色后的凝胶进行脱色。

5.由于溴化乙锭具有一定的毒性，试验终止后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康，处理方法如下：①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；

②参与一倍体积的0.5mol/LKMnO4，混匀，再参与等量的25mol/LHCl，混匀，置室温数小时；

③参与一倍体积的2.5mol/LNaOH，混匀并废弃。

（现在国际上更多的试验室已经不再使用EB，而是使用Invitrogen公司的SYBRsafeDNAgelstain来代替，效果完全可与EB媲美，使用上更安全。）

三、试验材料、试剂和仪器：

1.材料：上次试验课PCR扩增的河蟹CHH基因产物；

2.试剂：琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液（2mol/LTris碱，1mol/L冰醋酸，100mmol/LEDTA）、标准分子量DNA（Marker）、6×loading上样缓冲液[30mMEDTA，36%(v/v)Glycerol（甘油），0.05%(w/v)XyleneCyanolFF（二甲苯青FF)，0.05%(w/v)BromophenolBLUE(溴酚蓝)]、溴化乙锭（EB）；

3.仪器器皿：电子天平、量筒、微波炉、烧杯、微量移液器、一次性手套、电泳仪、紫外成像仪。

四、试验步骤：1.制胶：

（1）依照1%的浓度比例称取1g琼脂糖粉末置于烧杯中，参与100mL1×TAE电泳缓冲液，晃匀后放入微波炉中加热约2min至完全融解；

（2）待凝胶温度降至不烫手时，参与少量EB（约1-2uL）；（EB量太大会导致紫外成像时凝胶背景太亮，从而不易与目的条带形成显明对比）

（3）将凝胶倒入放在水平桌面上的制胶槽中（制胶槽预先用胶带封闭两端，放好梳子），如有气泡，可用枪头粗端去除，室温约15-20min至凝胶完全凝固；

（4）拔出梳子，将凝胶连带制胶板一起放入电泳槽中，切记：凝胶的点样孔在负极（黑色）一侧。2.DNA电泳：

（1）将DNA样品与6×DNA上样缓冲液（体积比为1：6）混合均匀（可在一次性手套或封口膜上混合），依次参与凝胶点样孔中；（注意：枪头尖部不要碰触凝胶，防止刺穿凝胶，另外样品全部推出到点样孔中之后，仍须按住微量移液器，至枪头离开液面后再松手，平日好多同学提前松手，导致样品又被吸回到移液器中）

（2）连好电源线，开启电泳仪，调至恒压状态，电压设定为约90V；（电压设定视状况而定，寻常高电压跑得快，但假使条带多则易聚集在一起，不简单区分，而低电压跑的慢，条带之间迁移的较开，易于区分）

（3）电泳终止后，先将电压调至0，再关闭电泳仪，拔下电源线，取出凝胶，置于紫外成像仪上进行观测和拍照。（注意：污染的手套不要触摸任何非污染区和设备，假使不经过电脑裸眼观测时，一定要将有机玻璃盖板置于紫外灯管上，否则简单损伤眼睛）

五、试验结果：

可放照片加以说明，或者画示意图说明，标明所见条带、dimer及Marker。六、分析探讨：

1.加EB时应防备，要戴至少两层一次性手套；EB加量不要太大，否则反而影响对DNA的观测；

2.假使PCR产物不单一，则应低电压跑电泳，这样条带之间分开效果较好；3.缓冲液的pH值直接影响DNA的解离程度和电荷密度，缓冲液pH为8.0时，DNA氨基几乎不解离，磷酸全部解离带负电，因此向正极泳动；

4.在电泳中，6×loading上样缓冲液可显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。loadingbuffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳，寻常溴酚蓝迁移到凝胶的2/3处电泳就可中止了；其次，里边的成分“甘油〞可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品漂出点样孔。另外有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明，SDS主要是促使聚合酶变性，由于没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。在酶切反应中参与loading，是为了中止酶促反应。

试验四：从琼脂糖凝胶中回收目的DNA

一、试验目的：

熟练把握用柱回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的DNA的方法，为后续将其连接到载体中做准备，由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列试验——譬如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等工作。二、试验原理：

1.胶回收的质量直接影响后继试验的成功与否，要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂盒，最基本的评定标准无外乎这样几个：质量（回收产物的纯度和浓度）、回收效率、操作便利（速度）、柱子的载量等；

（1）回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，猛烈抑制后续的连接、酶切、或者标记、扩增等试验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是要考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，假使机械剪切力使得回收产物大小不一致，则无法进行后续试验。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。由于产物浓度太小，对后继试验同样也有影响，譬如连接、标记试验等等就很不顺利，往往需要再浓缩一次，增加了操作的繁杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生严重的影响；

（2）回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量寻常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继试验来说是十分重要的。回收率的多少寻常和回收产物的大小以及量的多少有关，譬如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；又譬如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据状况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的；

（3）操作方面：相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来便利的方法或者产品。譬如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很便利的设计；离心过柱就比离心沉淀要简单便利等等；

（4）柱子的载量：就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，由于对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉了，假使有时需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势；寻常我们使用的胶回收试剂盒中的柱子

的载量是一定的，每个纯化柱最多可以回收30ug的DNA，所以切胶时胶块不宜太大，否则简单造成部分DNA的损失；2.胶回收方法和分类：

（1）柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法。回收柱上具有硅胶膜，在高盐、低pH的条件下可以高效、可逆地吸附DNA片段，将其它杂质与DNA分开，在低盐、高pH的条件下可以将吸附在硅胶膜上的DNA洗脱收集，达到纯化的目的；只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer完全溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后续试验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法，但是这个方法可以回收50bp~40kb的DNA片段，不适用于更大片段DNA的回收。后面要介绍的好多方法在柱回收试剂盒推出后都渐渐要淘汰了，由于比较费时吃力，而且回收的产物纯度也不比试剂盒，有条件还是选择试剂盒，比自己渐渐摸索要更能俭约宝贵的青春。

（2）玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收试验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得试验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，（区别在于这里）参与纯化填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，枯燥沉淀，最终用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者繁杂一些，涉及到屡屡离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀；另外枯燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液参与到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，这样就避免了上述的问题。

（3）低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温溶化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。最好的低熔点琼脂糖为GTG级别（遗传技术级），电泳后，直接将条带切下65度保温溶化，就可以直接在溶化的琼脂糖—DNA混合物中加酶进行后继试验，可以在凝胶中进行各种酶反应，试验条件温柔，十分适合大片断的回收。

（4）透析袋电洗脱法：烦，简直不堪回首。切下的条带放在充满TAE的透析袋中，再电泳一段时间，让DNA走出凝胶，走向溶液中，再反向电泳一会儿，将附在透析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀，那块胶寻常还要再染色看看残留，只有在万不得已的十分大的片断时才会考虑此法。这也是丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。

（5）DEAE纤维素膜纸片法和其它改良法：早期试验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，由于洗脱比较困难。小结：

常规片断级（DNA片段为100bp-10kb）：主流方法是柱回收试剂盒；

大片段级（DNA片段>7kb）：可选方法是玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒，电洗脱；小片段级（DNA片段

四、试验步骤：以宝生物的T-载体试剂盒为例

1.在PCR小管中参与T-载体试剂盒中的SolutionI溶液2.5μL；2.再参与经胶回收纯化的目的基因2μL；3.最终参与T-载体0.5μL；

4.用移液器混匀后离心机轻甩，16℃过夜连接。

五、试验结果：

连接试验结果成果与否需要通过转化试验才能确定。六、分析探讨：

1.Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依靠的A，但假使放置时间过长，A会脱落，则不能与载体连接，所以目的基因经胶回收后，要尽快完成连接反应；2.试剂盒中的SolutionI溶液因含有连接酶，避免反复冻融，在首次使用时应分装至2.5μL/管，用时冰上溶化。

3.假使使用Promega公司的pGEM-T载体系统，则需要T4-DNA连接酶，连接反应条件为4℃过夜连接。

试验六：感受态细胞的制备

一、试验目的：

把握CaCl2法制备感受态细胞的原理及方法。

二、试验原理：

1.基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存活于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。大肠杆菌是目前最成熟的克隆受体，其遗传突变材料也是最丰富的，针对其开发的载体也是最完善的。遗传物质的转移有三种方式：转化、转导和转染。转化是一种遗传转移方式，在自然界普遍存在，1928年Griffith首次在肺炎链球菌中发现，即来自一个细菌细胞（供体）的DNA（片段）被另一个细胞（受体）所吸收，并在受体细胞中生存下来。对DNA的吸收，一般发生在受体生长周期中的一个短暂阶段。细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态（competence），处于感受态的细胞称作感受态细胞（competentcell），经转化获得外源

遗传物质的细胞称转化子（transformant）。在大肠杆菌中还没有发现明确的与感受态有关的遗传因子，因此大肠杆菌的感受态需要物理或化学的诱导才能产生。常用的有CaCl2转化法和电转化法。

2.最经典的大肠杆菌转化是通过CaCl2来诱导感受态的形成，其操作核心是将大肠杆菌细胞在CaCl2水溶液中浸泡一段时间，经过处理后，Ca2+可与DNA结合形成羟基钙磷酸复合物吸附在菌体细胞表面，使大肠杆菌细胞对DNA的吸附能力显著提高，转化效率可达107~109转化子/ugDNA，同时Ca2+还能抗DNase，防止外源DNA被降解。所谓感受态是让细胞胀起来，使细胞膜滚动性差；热击后马上冰浴，使菌体表面晶格结构被破坏，形成孔洞，外源DNA进入细胞实现转化。

3.常用的大肠杆菌受体菌株有DH5α、TG1、XL-1Blue、JM109和TOP10等。4.在制备感受态时，所用的操作都必需在冰浴中进行，保持细胞的最低生物活性。感受态在4℃可维持1-2天，在10%甘油溶液下于－70℃可长期保存。为了提高转化效率，在CaCl2处理时可辅助使用Mg2+、Co2+和Ru2+等二价阳离子或二甲基亚砜（DMSO）。

三、试验材料、试剂和仪器：1.材料：菌株E.coli（DH5α）；2.试剂：

（1）LB培养基：蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、NaCl(10g/L)、1MNaOH(1mL/L)；（2）灭菌的0.1MCaCl2；3.器材及设备：

微量移液器、振荡恒温培养箱、制冰机、1.5mL离心管、离心机。

四、试验步骤：

1.取20μL-20℃保存的大肠杆菌（DH5α）的甘油菌，参与到5mLLB培养基中，在37℃，200rpm条件下过夜培养12~16小时，以活化菌体；

2.其次天早上将过夜培养的5mL菌体参与到100mLLB培养基中扩大培养；3.37℃，200rpm，培养约1hr；

4.冰上，将培养好的菌体分装到1.5mL离心管中，每管1mL菌体；5.室温条件下，10000rpm离心15s，每管底有1mm2的菌体足矣；6.每个EP管中参与200μL冰预冷的0.1MCaCl2；

7.轻柔重悬菌体，4℃冰浴4hr后即可使用；或参与10%甘油，液氮速冻后，-80℃可保存数月。

五、试验结果：

感受态制备成功与否需要通过转化试验的结果才能确定。

六、分析探讨：

1.使用的CaCl2溶液要灭菌后冰预冷；

2.用于制备感受态细胞的大肠杆菌菌体应在对数生长期收获；3.质粒液体（连接液）体积不能超过感受态细胞液体体积的10%；

试验七：热激转化试验

一、试验目的：

1.学习把握外源DNA热激转化大肠杆菌感受态细胞的原理和方法；

2.将本试验中的外源目的DNA（Es-CHH基因）转化入大肠杆菌DH-5α菌株中。

二、试验原理：

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作，可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。目前常用的转化方法主要有两种：

（1）热激法：大肠杆菌在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态；此外，Ca2+能与参与的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑拣所需的转化子。（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于将其运输进细胞也十分重要。

三、试验材料、试剂和仪器：1.试剂：LB液体培养基

2.大肠杆菌DH-5α菌株、目的基因连接到克隆载体的连接液；

3.仪器设备：微量移液器、制冰机、离心机、离心管、水浴锅、振荡培养箱、超净工作台等。

四、试验步骤：

1.取200μL感受态细胞，加5μL连接液，轻轻混匀。冰上放置30min；2.42℃热激90s，冰上放置2min；

3.加800μLLB培养基（Amp-），37℃、150rpm振荡培养1h；

4.室温4000rpm离心5min，吸出900μL上清，用剩余培养基悬浮细胞；5.将细菌涂布于氨苄青霉素（100ug/ml）平板上；

6.将平板在37℃正向放置1h吸收多余液体，然后倒置培养过夜。

五、试验结果：

在过夜培养的AMP+平板上长出了数十个白色的菌落克隆。

六、分析探讨：

1.热激之前的冰浴处理目的：可以让质粒DNA分子处于大肠杆菌细胞膜的入口处，热激可以使这些DNA分子进入到寄主细胞中，热激之后的冰浴可以让菌体细胞膜表面的孔道关闭；（Incubatethecompetentcells(CaCl2treated)andtheplasmidDNAonicecouldletplasmidDNAmoleculesareattheentriesofahostcellmembrane,andtheheatshockcouldletthoseplasmidDNAmoleculesenterintothehostcell.Afterheatshock,thecellshouldbecoldoniceagaintoletthegatesonthecellmembraneclosed.）

2.利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上最好不要超过105个菌落），否则不易长成单菌落，而易形成菌苔；同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周边的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。3.鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有：1)a互补；

2)杂交筛选；

3)插入失活（一些老质粒如pBR322等）；4)小量提取质粒酶切检测、PCR检测。

4.培养板要倒置培养，防止正放时皿盖上的水珠滴入培养基使菌落混合污染；5.涂布棒每次使用前要灼烧，防止污染，待冷却后，再进行涂布；

试验八：挑取阳性克隆、PCR检测、保种、送测序

一、试验目的：

把握用PCR检测所得到的克隆是否为阳性克隆的方法。

二、试验原理：

根据试验五中所介绍的试验原理可知：在Amp+平板上长出的白色菌落单克隆在理论上应当是已经质粒中有插入片段的转化后的大肠杆菌，但假使插入片段不是目的基因的话，也会长出白色单克隆，即为假阳性克隆，所以需要通过PCR检测确定插入的是否为目的基因。通过PCR检测后，根据扩增片段的大小可以大致确定是否插入的为目的基因，但进一步最终的确定，需要将挑拣出来的阳性克隆进行测序确认。

有时在较大的单菌落周边，会有好多小的白斑，那应当是卫星菌落，假使载体的抗性是氨苄的，是经常出现这种状况的，极有可能是氨苄失效或者是其它杂菌有分解氨苄的能力，相比而言卡那霉素比较好用，卡那抗性载体是不会有卫星菌落的，由于他的作用原理是杀菌不是抑菌。有些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素，当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，也会形成卫星菌落。

连接体系往往需要优化，即载体和需连接的片段的相对比例必需适中，才会产生一定数量的转化子，比例过大过小都不好，可以做个试验，配几个不同比例的体系来分别转化试试，以后做连接也可以有参照。

三、试验材料、试剂和仪器：

1.材料：转化后Amp+平板上长出的白色菌落单克隆；

1.在离心管中参与ddH2O10.5μL；2.参与10×Kbuffer2.5μL；

3.参与含有目的基因片段的T载体质粒10μL；4.参与内切酶各1μL；

5.用移液器轻轻混匀后，置于33℃恒温箱中过夜酶切；

—————————————————————————————————————（今天的试验到此终止，后面的内容由老师来做，最终抽时间给大家看结果，后面虽然不做了，但让学生记录下试验步骤）

6.电泳检测酶切结果，胶回收带有粘末端的目的片段，进行后续与表达载体的连接或于-20℃保存。（二）连接：

1.按如下连接体系加样：

ddH2O10.5μL10×T4DNA连接酶buffer5μL酶切后带有粘末端的目的片段30μL表达载体3μLT4DNA连接酶2μL

2.用移液器轻轻混匀后，置于16℃恒温箱中过夜连接；3.随后即可进行转化、测序、诱导表达等工作（略）。

五、试验结果：

试验结果需要在转化后进行测序验证是否连接成功。

六、分析探讨：

1.内切酶不是加的越多越好，由于在酶液中参与了甘油作为抗冻剂，所以加的酶越多，带入的甘油也越多，甘油会影响酶切的效果；

2.连接反应中，载体与目的DNA片段的分子摩尔数比例为1:3~1:10；

2.T4连接酶需要ATP参与反应，一般要在缓冲液中参与一定量的ATP，由于ATP不稳定，需要保存在-20℃，用时置于冰上溶化。

2.试剂：LB液体培养基（Amp+）；

3.仪器耗材：超净工作台、1.5mL离心管、酒精灯、微量移液器、台式离心机、PCR仪、恒温振荡培养箱。

四、试验步骤：

1.每个单克隆对应一个1.5mL离心管，编号；在每个离心管中参与800μL液体LB培养基（Amp+）；

2.用灭菌牙签或灭菌枪头，挑取转化后Amp+平板上长出的白色菌落单克隆，到加有液体LB的培养基（Amp+）中；3.37℃,200rpm，摇床培养5-6小时；

4.将培养后的菌液取1μL作为PCR反应的模板，选用试验一中的序列特异性引物，进行PCR扩增，经过电泳检测，挑取PCR检测正确的菌液进行克隆测序。5.将剩余菌液按10%-15%的比例参与灭菌甘油后，-20℃保存备用。

五、试验结果：

正确插入目的基因的克隆经PCR检测后，在预期大小处有单一强条带，则选取该菌液送测序。六、分析探讨：

1.挑取单克隆时，注意无菌操作；

2.应选择较大、较透明的单一白色菌落进行检测。

试验九：碱裂解法提取质粒DNA

一、试验目的：

1.把握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法；2.了解质粒DNA电泳检测的特点。

二、试验原理：

1.碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分开目的。细菌质粒是一类双

链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，寻常状况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有大量方法可用于质粒DNA的提取，本试验采用碱裂解法提取质粒DNA。

2.SolutionI的成分主要包括：葡萄糖、EDTA、RNase、Tris-HCl缓冲液。其中，葡萄糖具有增稠的作用，使悬浮后的菌体不会快速沉积到管子的底部；EDTA可以抑制DNase的活性，防止质粒DNA的降解；RNase可以降解体系中的RNA，本身不受DNase的影响，并且可以在后续步骤中被除去；Tris-HCl缓冲系统维持pH为8.0。

3.之所以称为碱裂解法，由发挥主要作用的SolutionII的成分而得名，SolutionII中主要包括：NaOH和SDS（十二烷基磺酸钠）；其中NaOH主要作用是破碎细胞，SDS作为一种阴离子表面活性剂，主要作用是使DNA与蛋白变性。参与SolutionII后，溶液pH值高达12.5，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分开。

4.SolutionIII的成分主要包括：醋酸钾和醋酸；当参与pH4.8的SolutionIII高盐缓冲液后，可以迅速调理其pH值至中性，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，为可溶状态，保存在溶液中；而染色体DNA不能复性而形成不溶的缠连网状结构；同时该溶液中醋酸钾中的钾置换了SDS中的钠，形成PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀，在上一步中，SDS与蛋白质结合，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，由于钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀下来，同时基因组DNA也被PDS共沉淀了；通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-PDS复合物、细胞碎片等一起沉淀下来而被除去。

三、试验材料、试剂和仪器：1.材料：菌体E.coli（DH5α）；2.试剂：

（1）LB培养基：蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、NaCl(10g/L)、1MNaOH(1mL/L)；（2）SolutionI：50mM葡萄糖；25mMTris-HCl(pH8.0)；10mMEDTA(pH8.0)；RNase；（3）SolutionII：0.2MNaOH；1%SDS。

（4）SolutionIII：3M醋酸钾；2M醋酸(pH4.8)；（5）Elutionbuffer：Tris-HCl和EDTA(TE)；

3.仪器：恒温振荡培养箱、1.5mL离心管、台式离心机、微量移液器。

四、试验步骤：（以生工质粒小抽试剂盒为例）1.准备工作：

（1）检查BufferP1中是否已经参与RNaseA；（2）检查WashSolution中是否已经参与乙醇；（3）检查BufferP2和P3是否出现沉淀；

2.取3ml过夜培养的菌液，8000g离心2min收集菌体，弃尽培养基；3.在沉淀中参与250μLBufferP1，完全悬浮菌体；

4.参与250μLBufferP2，马上温柔颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2min；5.参与350μLBufferP3，马上温柔颠倒离心管5-10次混匀，室温静置5min；6.12000g离心10min，将上清液移入spin吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中液体；

7.（选做）参与500μLBufferDW1，9000g离心30sec，倒掉收集管中液体；8.参与500μLWashSolution，9000g离心30sec，倒掉收集管中液体；9.重复步骤8一次；

10.空spin吸附柱于9000g离心1min；

11.将吸附柱放入一个清白的1.5ml离心管中，在吸附膜中央参与50μL预热（55℃）的ElutionBuffer，于55℃水浴中静置1-2min后，9000g离心1min，-20℃保存管中质粒DNA溶液。

五、试验结果：

电泳检测（由研究生代做），可给学生介绍质粒DNA三种构型在电泳中的迁移特点。六、分析探讨：

1.离心收集菌体时，注意转速不能太大，防止菌体破碎；

2.在SolutionI中需要参与RNase，以降解RNA，用毕保存于4℃中；

3.使菌液悬浮时要轻，特别是参与SolutionII时，一定要轻柔混匀，假使猛烈的话，易造成基因组DNA的断裂，形成小片段，不易与质粒DNA分开，影响试验结果。

试验十：质粒DNA的限制性内切酶酶切及连接（载体构建）

一、试验目的：

1.把握载体构建的基本原理及方法；

2.构建含有中华绒螯蟹CHH基因的表达载体。

二、试验原理：

1.载体构建(vector