放射自显影影像

放射自显影影像第1页/共69页本章重点：放射自显影的定义放射自显影的基本类型和基本方法放射自显影的感光材料第2页/共69页一概述1、定义：放射自显影:利用射线使感光材料感光形成潜影，经显影定影后形成图像；判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量）的技术。第3页/共69页第4页/共69页2、放射自显影的发展1867年:铀盐可以使银离子感光；1924年Lacassagne应用于研究钚在生物标本中的分布1946年，Belanger和Leblond首次建立现代放射自显影的方法。第5页/共69页3、放射自显影的优点1）灵敏度高。2）定位准确，能把定位和定量结合分析3）感光材料具有累积成像的效应，所需的放射性物质可极微量。4）操作简单易行，不需要复杂昂贵的设备。5）形态、机能和代谢的综合分析6）结果可以长期保存第6页/共69页局限性：1、实验周期长。2、定量不准确，只能半定量。第7页/共69页4、应用举例药物、营养物质、毒物等在器官、组织、细胞中的分布、运转研究特异性标记前体的参入部位、特点、影响因素标记抗体或药物在离体标本上进行抗原研究或受体的定位示踪第8页/共69页二放射自显影的原理（一）潜影形成的原理：和普通光学摄影原理相同；利用射线使感光材料感光在标本中放射性存在的原位置出现银颗粒的沉积。第9页/共69页1、电离：释放电子感光乳胶中每颗溴化银结晶由许多AgBr分子组成。制造乳胶时，都使晶体发生点阵上的缺陷－－敏化中心。第10页/共69页具有缺陷的晶格排列完整的晶格排列第11页/共69页当核射线作用于溴化银结晶时，使某些分子电离射出电子，向敏化中心移动形成阴电层。AgBr+β--Ag++Br+e-第12页/共69页第13页/共69页2、Ag+离子向敏化中心移动：Ag+离子向敏化中心移动，与电子结合，即射出的电子被带正电荷的银离子俘获，形成银原子。Ag+＋e+--Ag第14页/共69页3、形成潜影许多带正电荷的银离子被显影剂还原成银原子，在该溴化银结晶颗粒中形成潜影。第15页/共69页第16页/共69页（二）潜影的消退：已经还原的银原子在水、氧的作用下重新变成离子，使已经形成的潜影消退。放射自显影的曝光过程应在干燥、低温或充氮气的环境下进行。第17页/共69页（三）显影和定影显影液将银离子还原成银颗粒的过程显影液=显影剂+促进剂+保护剂+抑制剂显影剂：还原作用，米吐尔、海德尔促进剂：提供碱性环境，增加显影作用，常用碳酸钠保护剂：中和还原产物，亚硫酸钠抑制剂：抑制未形成潜影的银盐分解，溴化钾第18页/共69页第19页/共69页定影：定影液溶解未形成潜影的银晶体。定影液=定影剂+保护剂+停显剂+坚膜剂定影剂：溶解银晶体，海波保护剂：抑制定影剂被酸分解，亚硫酸钠停显剂：终止显影液的继续作用，醋酸坚膜剂：防止乳胶膨胀、脱落、擦伤。钾矾第20页/共69页三放射自显影的材料（一）感光材料：1、组成由银盐和明胶组成。银盐多为卤化银，如溴化银。明胶主要起支持作用；吸水膨胀后具有通透性第21页/共69页第22页/共69页2、分类：（1）原子核乳胶：溴化银和明胶按照一定的比例混匀制备而成；常温下呈粘稠液状，低温下则为胶冻状，温度升至40℃左右时为液态。可以根据使用需要制备成各种形态第23页/共69页①液体核乳胶：由溴化银和明胶按照80：20的比例混合制备，可制备成不同形状和厚度。②核乳胶干板：核乳胶胶片③揭膜核乳胶：第24页/共69页

中国原子能科学研究院物理生产的核乳胶乳胶型号核-2核-4HW-3HW-4银晶直径（μm）0.170.240.10-0.110.14适用范围α粒子11MeV以下的质子所有带电粒子所有带电粒子（电镜自显影）第25页/共69页（2）氚片：由溴化银、碘化银和明胶组成。银晶体颗粒平均直径为1μm单面涂胶主要用于3H标记化合物的自显影第26页/共69页（3）X线片：由溴化银、碘化银和明胶组成。银晶体颗粒平均直径为2.5μm双面或单面涂胶主要用于射线能量较高的宏观自显影第27页/共69页乳胶类型溴化银直径（μm）乳胶层的厚度（μm）用途原子核乳胶0.1~0.24

光镜、电镜自显影氚片1.05~10宏观自显影X光片2.5~3.015~30核素能量较高宏观自显影第28页/共69页（4）自显影增强剂：在感光材料里面加入荧光材料或将荧光材料制作成薄膜覆盖在凝胶表面。感光材料在射线和光子的双重作用下面感光，可以缩短实验周期。第29页/共69页暗盒和增强屏第30页/共69页（5）磷屏成像：用可重复使用的磷屏作为成像板专门的读出装置。第31页/共69页计算机磷屏成像系统第32页/共69页优点：可用于多种核素的宏观自显影操作简便不需胶片和显影定影等照相处理步骤磷屏可以重复使用缺点：分辨率较低目前还不能用于高倍光镜和电镜自显影仪器价格比较昂贵第33页/共69页（二）放射自显影中常用的放射性核素应考虑其射线的种类、能量和半衰期。3H、14C、35S、45Ca、32P、33P、131I、125I、99mTc等。发射射线的核素毒性都较大，一般不用于示踪研究。单纯的发射射线的放射性核素，难于在乳胶中形成潜影，自显影效果差。第34页/共69页核素半衰期β-粒子最大的能量（MeV）β-粒子平均能量（MeV）3H14C32P35S45Ca59Fe89Sr125I131I12.33年5730年14.28天87.4天165天44.6天50.5天60.2天8.04天0.01880.1551.710.1670.2580.461（51%）0.269（47%）1.488——0.6070.0050.050.6950.0550.100.120.570.0037内0.0227俄0.205放射自显影常用的放射性核素第35页/共69页四放射自显影的基本技术和方法（一）主要类型：宏观自显影：整体水平光镜自显影：细胞水平电镜自显影：亚细胞水平第36页/共69页1、宏观自显影：常用肉眼、放大镜或低倍显微镜观察用灰度或黑度对比来判断示踪剂的部位和数量优点是可以同时观察各脏器、组织中放射性示踪剂的分布，多用于小动物的整体标本，大动物的脏器或肢体，以及各种电泳谱、色谱和免疫沉淀板等的示踪研究。第37页/共69页第38页/共69页第39页/共69页小鼠头部的宏观自显影第40页/共69页凝胶电泳的自显影结果第41页/共69页核酸电泳展开板的放射自显影第42页/共69页2、光镜自显影：以光学显微镜为工具进行观察，以镜下的银颗粒分布及数量来判断放射性核素示踪剂的部位和数量。镜下的银颗粒为黑色或深棕色的小圆点适用于冰冻组织切片、石蜡组织切片，血细胞涂片、骨髓细胞涂片等标本的示踪研究。第43页/共69页第44页/共69页放射自显影检测寄生虫感染中的脾细胞第45页/共69页3、电镜自显影：以电子显微镜观察，以电镜下银颗粒的分布及数量来判断。电镜下电子轨迹为蛇样扭曲适用于细胞超微结构上的精确定位和定量第46页/共69页第47页/共69页蛇毒素与乙酰胆碱受体结合第48页/共69页（二）基本方法1、基本步骤：示踪：向实验动物体内或离体标本上引入放射性核素标记物。标本制备：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片自显影制备：暗室中在制备的标本上敷加感光材料。曝射：避光条件下核射线作用于感光乳胶。照相处理：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。⑥阅读分析。第49页/共69页2、示踪剂引入的方法①体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔注射或直接脑内注射和灌胃等途径给入放射性标记化合物。②体外实验：可在培养瓶中给入、或将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，洗去多余的示踪剂后再进行自显影实验。第50页/共69页3、标本制备：①组织切片：冰冻切片：石蜡切片：第51页/共69页第52页/共69页②整体动物切片：专用整体动物切片机上制成第53页/共69页第54页/共69页③牙齿、骨骼：制备磨片④体液、细胞：制备涂片⑤电镜标本：超薄切片机⑥其它：电泳条、层析条等可干燥后使用第55页/共69页4、自显影片的制备方法：①液体乳胶浸膜法：

在暗室中将液体核乳胶置37℃－40℃水浴融化，玻棒搅拌15min至均匀。将载玻片带标本的插入乳胶内，浸沾乳胶，约0.5min后缓慢匀速地垂直提出。干燥过夜。在有干燥剂的暗盒内，密封置4℃曝射。然后显影、定影、染色、封固等则在自显影结束后进行。第56页/共69页第57页/共69页②接触法：将样品摆放在合适的载波片上，取与载波片大小相同的核乳胶干板覆盖在载波片上，用橡皮筋固定，外面包上黑纸，然后4度密封保存充分曝光。

注意：接触松紧要适当以免引起挤压效应第58页/共69页

接触法示意图第59页/共69页③湿贴法：暗室中将冰冻切片直接贴在干板的乳胶面，冷冻干燥后曝射。第60页/共69页第61页/共69页④揭膜法：将核乳胶制备成核乳胶揭膜，悬浮于液体中。用固定好样品的载波片在液体中捞取揭膜，使揭膜覆盖在样品上。第62页/共69页第63页/共69页⑤金属环法：电镜自显影在暗室内融化乳胶，按说明书要求稀释，降温至25℃，用不锈钢制成的金属环（直径4毫米）插入乳胶液中，轻轻垂直提取，金属环上即形成单层乳胶膜。将环套在载有超薄切片的铺有火棉胶的铜网上，单层乳胶膜即覆盖在切片表面。曝射后显影定影，干燥后即可在电镜下观察。第64页/共69页第65页/共69页5、曝射放射自显影的曝光时间与所使用的放射性核素种类有关。

125I需要感光48小时以上。

14C要数天～几周。

3H要10天以上，