蛋白质和维生素的测定选用

样品蛋白质系数样品蛋白质系数小麦粉及其制品5.70畜禽肉及其制品6.25全麦5.83芝麻5.30大米5.95乳类6.38花生5.46黄豆5.713、蛋白质系数

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质含氮量为16％，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同。第六节蛋白质的测定现在是1页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定二、测定方法蛋白质测定方法凯氏定氮法蛋白质快速测定法现在是2页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（一）凯氏定氮法1、原理

2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O现在是3页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定2、仪器凯氏烧瓶、可调式电炉、蒸汽蒸馏装置现在是4页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定3、试剂（1）硫酸铜（CuSO4·5HO2）；（2）硫酸钾；（3）浓硫酸；（4）40％氢氧化钠溶液；（5）4％硼酸溶液；（6）0.1mol／L盐酸标准滴定溶液（7）95%乙醇。（8）甲基红一次甲基蓝混合指示液将次甲基蓝（乙醇溶液1g/L）与甲基红（乙醇溶液1g／L）按1十2体积比混合。现在是5页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定4、操作方法样品消化→蒸馏→滴定（1）样品消化样品+0.2g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗现在是6页\一共有54页\编辑于星期五（2）蒸馏第六节蛋白质的测定按下图连接好蒸馏装置图加水至2/3体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性夹紧螺旋夹加热蒸汽发生瓶中的水，检查整套装置是否有漏气现象，不能漏气现在是7页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（2）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂2～3d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。现在是8页\一共有54页\编辑于星期五吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源第六节蛋白质的测定现在是9页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。现在是10页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定5、计算现在是11页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定6、说明及注意事项（1）

试剂溶液应用无氨蒸馏水配制（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，消化中不时转动凯氏烧瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固体残渣，促进其消化完全。（3）为加速消化，常加入硫酸钾：可提高消化体系溶液温度硫酸铜：催化剂、消化终点指示剂、蒸馏时碱性反应指示剂现在是12页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（4）样品中若含较多脂肪或糖，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。（5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续加热消化。（6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（7）一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，一般消化时间约4小时，时间延长可能引起氨的损失。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。（8）蒸馏装置不能漏气现在是13页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（9）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量（10）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱，置于冷水浴中使用。（11）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面,清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。现在是14页\一共有54页\编辑于星期五（二） 微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量由50ml变为10ml,滴定用盐酸浓度由0.1mol/L变为0.01mol/L,可用微量滴定管。3.仪器有了一定改进。现在是15页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（三）自动凯氏定氮仪法在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。仪器：消化炉自动蒸馏装置现在是16页\一共有54页\编辑于星期五第六节蛋白质的测定（二）蛋白质快速测定法双缩脲法紫外分光光度法染料结合法水杨酸比色法现在是17页\一共有54页\编辑于星期五第七节维生素的测定一、概述二、水溶性维生素的测定三、脂溶性维生素的测定维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。维生素水溶性维生素脂溶性维生素维生素B、C等维生素A、D、E、K现在是18页\一共有54页\编辑于星期五第七节维生素的测定维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。现在是19页\一共有54页\编辑于星期五第七节维生素的测定

我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。现在是20页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，持别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。现在是21页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定

维生素C的测定总维生素C包括：还原型、脱氢型及二酮古乐糖酸。维生素C常用的测定方法有测定方法2,6-二氯靛酚法（还原型VC）荧光法2,4-二硝基苯肼法

(总VC)碘酸法

碘量法

GB/T5009.86—2003第一法GB/T5009.86—2003第一法现在是22页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定（一）二氯靛酚法（测定还原型抗坏血酸）1、原理还原型抗坏血酸还原型2，6-二氯靛酚法（无色）H+2，6-二氯靛酚法（粉红色）+脱氢型抗坏血酸+2、试剂（1）2%草酸溶液（2）0.000167mol/LKIO3标液（3）1%淀粉溶液；（4）6%KI溶液；现在是23页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定（5）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)标定：吸标液（VC）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001NKIO3标液滴定到淡兰色。现在是24页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定（6）0.02%2，6—二氯靛酚溶液标定：吸5ml已知浓度VC标液→加5ml1%草酸→用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点。计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）现在是25页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定3、测定步骤样品还原型Vc的提取还原型Vc的测定（1）提取鲜样的提取：称100g鲜样加等量1%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释定容，混匀。干样的制备：称1-4g（含1-2mg抗坏血酸）放入研钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，用草酸溶液定容到100ml。上述溶液若颜色深，可加入白陶土，将上述溶液过滤，滤液备用。现在是26页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定（2）滴定吸取5-10ml滤液，置于50ml三角瓶，快速加入2,6—二氯靛酚溶液滴定，直到红色不能立即消失，而后再尽快，逐滴加入，以呈现的粉红色在15秒内不消失为终点。现在是27页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定4、计算

V---消耗染料体积（ml）V0---滴定空白时所消耗的燃料的体积（ml）T--1ml染料所能氧化维生素C的毫克数含有样品的克数M---滴定时所取滤液中含样品重量，g现在是28页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定5、说明及注意事项（1）样品采取后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止维生素C氧化损失，测定过程要迅速。（2）若样品滤液颜色较深，可加入白陶土再过滤。不能使用活性碳进行脱色处理，因为活性碳会氧化维生素C，同时还会吸附维生素C。（3）贮存过久的罐头食品，可能含大量的Fe2+，要用8%的醋酸代替2%草酸。（4）本法适用于果品、蔬菜及其加工制品中还原型抗坏血酸的测定（不含二价铁、二价锡、一价铜、二氧化硫、亚硫酸盐和硫代硫酸盐）。现在是29页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定（二）2，4-二硝基苯肼法

1、原理还原型抗坏血酸脱氢型抗坏血酸氧化二酮古乐糖酸氧化二酮古乐糖酸2，4-二硝基苯肼＋脎520nm比色现在是30页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定2、试剂4.5mol/L硫酸（9+1）硫酸2%2，4-二硝基苯肼2%草酸抗坏血酸标准溶液1mg/ml2%硫尿1%硫尿1mol/ml盐酸1%草酸活性炭现在是31页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定3、测定步骤样品的制备显色硫酸处理比色氧化称一定样（100g)鲜样→加等量1%草酸→于高速捣碎机捣碎→取匀浆1—40g→用1%草酸定容100ml→过滤→滤液待用取滤液25ml→加2g活性炭→摇1分钟→静置过滤→弃去初滤液，取滤液10ml→加入2%硫脲溶液→混匀→得样品氧化液取上述氧化液各4ml于三支试管中→向其中两支管加入2%2，4-二硝基苯肼1.0ml,另一管作空白→将三支管加盖→于37℃保温箱3小时→取出后样品管放入冰水中→样品空白管取出后冷至室温→在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼1ml→置于室温下放置10-15min→样品管和空白管都于冰浴中向上述已放入冰水中的三支试管各加入（9+1）H2SO45ml于各管中（边加边摇）→将试管从冰浴中取出→室温下放置30分钟后立即比色，在520nm测吸光度，从标准曲线上查出相应的含量现在是32页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定4、标准曲线绘制加2g活性碳于50ml抗坏血酸标准溶液中，振摇1min，过滤，过滤。取10ml滤液置于500ml容量瓶中，加5.0g硫尿，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20ug/ml。取7个100ml容量瓶编号

1

2

3

4

567加VC标液20ug/ml

510

20

25

40

5060ml加硫脲溶液（ml）

95

90

80

75

605040ml2，4-二硝基苯肼（ml）1

1

11111ml按样品测定步骤进行显色反应，形成脎并比色。以抗坏血酸为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。现在是33页\一共有54页\编辑于星期五二、水溶性维生素的测定5、结果计算式中：X---样品中总抗坏血酸含量，mg/100gc---从标准曲线查得“样品氧化液”中总Vc的浓度，ug/mlV---试样用1%草酸定容的体积，mlm---样品质量，gF---样品氧化处理过程中的稀释倍数现在是34页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（一）性质（1）脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂（2）维生素A、维生素D对酸不稳定，维生素E对酸稳定。维生素A、维生素D对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸（3）维生素A、D、E耐热性好，能经受煮沸现在是35页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（二）脂溶性维生素测定脂溶性维生素测定样品预处理样品皂化脱脂脱脂样品有机溶剂提取脂溶性维生素有机溶剂提取液浓缩测定现在是36页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定

维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。

维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。现在是37页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定现在是38页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定1、高效液相色谱法测定食物中VA、VE

（GB/T5009.82—2003中第一法）

高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。这里介绍的是同时测定维生素A和维生素E的方法。

试剂：具体见教材重蒸水：蒸馏水中加少量高锰酸钾，临用前再蒸馏一次。现在是39页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定高效液相色谱仪的组成与工作主要流程如下图所示：现在是40页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（1）测定原理;样品中的VA和VE经皂化提取处理后，将其从可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将VA和VE分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。（2）操作步骤：样品处理、标准曲线的制备、设定好高效液相色谱条件、样品分析和结果计算现在是41页\一共有54页\编辑于星期五色谱条件（参考条件）：色谱柱：C18柱；流动相：甲醇+水（98+2）；流速：1.7ml/min；紫外检测波长：300nm；进样量：20微升。样品进样前需要用0.45微米的滤膜过滤，装入进样瓶中。现在是42页\一共有54页\编辑于星期五2、三氯化锑比色法（GB/T5009.82—2003中第二法）（1）原理维生素A+三氯化锑三、脂溶性维生素的测定氯仿溶液中兰色可溶性配合物620nm波长比色现在是43页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（2）适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品（含量高于5～10μg/g）。该法的主要缺点是生成的蓝色配合物的稳定性差，比色测定必须在6S内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。现在是44页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（3）试剂无水硫酸钠、乙酸酐无水乙醚（不含过氧化物）无水乙醇（不含醛类物质）三氯甲烷（不含分解物和水）250g/L三氯化锑—三氯甲烷溶液1+1氢氧化钠溶液、0.5mol/L氢氧化钾现在是45页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定（4）测定步骤样品预处理样品测定①样品预处理含有维生素A的样品大多需首先除去脂肪，把维生素A从脂肪中分离出来。常规的去脂方法是采用皂化法和研磨法。现在是46页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定A、皂化法:适用于维生素A含量不高的样品，但全部试验过程费时，且易导致维生素A的损失。皂化:称取0.5～5g经组织捣碎机捣碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入l0ml1：1氢氧化钾及20～40ml乙醇，在电热板上回流30min。加入10m1水，稍稍振摇,若无浑浊现象，表示皂化完全。现在是47页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定提取将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。再用50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗，振摇2min，提取不皂化部分。静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液呈蓝色为止。现在是48页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定洗涤在第一分液漏斗中加30ml水，轻轻振摇，静止片刻后，放出水层。再加入15～20ml0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇后，弃去下层碱液（除去醚溶性酸皂），继续用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止。醚液静置10～20rnin后，小心放掉析出的水。现在是49页\一共有54页\编辑于星期五三、脂溶性维生素的测定浓缩将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。用水浴蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下。减压抽干，