制剂的基本生产技术病毒增殖技术优秀公开课

第九讲

病毒增殖技术一、病毒的复制、增殖与营养吸附：非特异性静电－特异性受体影响因素：温度、阴、阳离子侵入：病毒直接进入胞浆；细胞吞饮病毒；病毒囊膜与细胞融合生物合成：细胞浆或细胞核中完成早期：合成酶类、核苷酸原料晚期：合成病毒结构蛋白装配：细胞浆或细胞核中完成核酸、蛋白质盘曲浓缩＋多肽－包壳＋细胞膜的脂质、糖类和病毒蛋白－病毒颗粒释放：细胞通道溢出；细胞死亡自溶释出；细胞膜出芽；细胞膨胀破裂放出掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病毒，对研制高质量生物制品十分重要。二、动物增殖病毒技术动物的选择：1大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康2对相应病毒易感，并十分敏感3经隔离饲养和观察检查证明健康4家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬、猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准5体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大4静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉5腹腔接种6脑内接种三、禽胚增殖病毒技术禽胚的选择1SPF鸡胚：无鸡的特定的22种病原体2非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体3鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚1卵黄囊2卵白3尿囊腔4羊膜腔5气室6壳膜1选择10～13日龄的鸡胚，划出气室和胚位2消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚面避开血管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜3用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷造成人工气室4在人工气室孔注入0.1～0.2ml病毒液，轻摇鸡蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上5用石蜡封口，35－37℃培养1选用10～13日龄鸡胚2在气室部位距气室分界线3～5mm处打一小孔3用细针头斜向蛋壳面插入约5mm，再退出于气室内注射4封口后直立，37℃，2h，不翻蛋5常规孵化，每日照蛋2次，及时取出死亡胚4℃，12h收获

消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明显部位，经研磨制成病毒悬液尿囊腔接种用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒卵黄囊接种法

5～8日龄鸡胚，在气室中心壳上钻一小孔针头沿胚的纵轴插入约30mm，封口，孵化主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低温保存备用羊膜腔接种法：1、操作在照蛋灯下进行，取10～12日龄鸡胚直立于蛋盘上，划出气室和胚胎位置2、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液3、封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔胚体接种法1、接种方法同脑内接种2、针头刺入胚体内接种静脉接种法1、11～14日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向2、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见3、用注射器顺血流方向刺入血管注入0.05～0.2ml病毒液，拔出针头可以不封口，孵化，弃掉24h内死胚4、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头，可得0.05～0.5ml血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳膜之上，用吸管吸取，可得0.5ml血液（三）影响禽胚增殖病毒的因素种蛋质量：

病原微生物：污染制品本身，又影响接种病毒在鸡胚中的增殖

母源抗体：影响病毒在鸡胚内的增殖

抗生素：影响病原体的增殖接种技术：

不同病毒有不同的接种途径，同种病毒接种不同日龄的禽胚获得的病毒量也不同；尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰当的接种胚龄；严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影响其发育。禽胚污染：接种时应严格无菌操作定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干四、细胞增殖病毒技术细胞的选择：病毒须在敏感的宿主细胞中增殖宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞可以根据病毒的细胞感染谱来选择细胞细胞培养病毒要素血清：56℃灭活30min，为了克服非特异性抑制因子的作用，血清浓度不超过2％温度：37℃pH：7.6～7.8接毒量与接种方法：按维持液的1～10％（V/V)量接种；异步接毒和同步接毒支原体污染问题影响病毒的增殖1干扰素诱导与干扰素活性抑制2病毒、支原体对共同营养需