遗传学实验双周周四

线粒体突变和黑腹果蝇的净化选择的遗拷贝的突变。不同的D型黑腹果蝇的线粒体组存在不同的突变标记组的D黑腹果蝇异质系这是通过将一个胚胎的极原生质注入另一胚胎来实现的每一个输入的（图表1a和补充表格1）抗线粒体组限制酶的特性。这两种突变型值得在此一提：mt:CoIT300Imt:ND2del1。同质的mt:CoIT300I型成熟果蝇能在25℃健康存活并发育繁殖但在29℃下仅存活4。这种温度敏感型等位基因为我们选择提供了机会而缺失了一段9个碱基对的等——mt:ND2del1——因为标记不合格，增加了我们在PCR析中追踪异质系的野生型mt:ND2del1的难度。同质的mt:ND2del1型幼稚果蝇能在25℃健康存活却会随着的增大出现越来越明显的野生型表越明显（补充表格1）。本次研究采用7种异质系组合（补充表格2）。某些异质系，例如mt:CoIT300I和mt:ND2del1组合型，在允许的温度范围内，两种在几代之间的传递没有出现明显的偏（图表1b）稳定的异质性可择。确实，mt:CoIT300I和mt:ND2del1组合型果蝇能在29℃健康存活，即使其中温度敏感型组的丰度很高（占95%）。因此，低丰度的mt:ND2del1组的存在有效避免了与mt:CoIT300I密切相关的温度敏感性表型的发生。同样的，能健康存活在29℃的同质的mt:ND2del1型果蝇的缺陷表型也不出现在异质果蝇中（补充表格1b）。因此，互为了量化来自mt:CoIT300Imt:ND2del1异质性母本（其中的不同的）的同质系后裔，我们用PCR术筛查了mt:CoIT300I缺乏型后代。如果母本含有低水平的mt:CoIT300I组（例如，表格1中含有1.29%mt:CoIT300I组的母本1），我们就采取这种筛查。并且，这种含量稀少的组被传递给大部分子代（图表2）。其它异质系也出现类似现（图表2和表格1统计来自同一异质系母本的多代，后代会出现越来越多的组分离（补充图表1）：这一结果是意料温度敏感型组和一种野生型组组成，或者和mt:ND2del1温度敏感型组的丰度逐代降（图表3a）当温度敏感型组很丰富时（约90%），下降值约20%。并且这一增额随着丰度的下降而减少（图表3b）。这种进行性的似乎是一种前奏，暗示着温度敏感型组的传递可能性总是低于野生型和mt:ND2del1型。感型组的丰度在十代以后下降至很小的百分比。到第18代，我们的四个培养基里无法检测到温度敏感型组（图表3a和补充图表2a）。因此，当温度敏感型组mt:CoIT300I和野生型搭配时，高对于温度敏感型组和mt:ND2del1型组合的异质系而言，其早会持续降至0%而是逐渐接近8%（图表3a）。即使是在50代之后温例存在较大的间差异。然而，经过32代的选择之后，两个相互独立的异质系所得的分析数据表明此差异并不（图表3c），这一现象表明所观察到的两种变异体线粒体组（分别只有6.0%和8.7%相反的当我们检测双变异体异质（mt:CoIT300Imt:ND2del1组合型）中的mt:ND2del1型时，我们发现：四种异质系中的两种缺乏温度敏感性表型；双变异体组在经历18的选择之后（图表证明了，在mt:CoIT300Imt:ND2del1组合型异质系中，温度敏感型基平衡选择意味着mt:ND2del1不编码全部的野生型功能。事实上，一个野生型和mt:ND2del1组合型的异质系暗示着mt:ND2del1型丰度逐代的进行性降（图表3a对于与这一组有关的温和表型，选择更倾向于淘汰温度敏感型组而当和mt:CoIT301S组组合时，对于mt:ND2del1型的淘汰就与温度敏感型的结果接近（补充图表3b）然而在另一组温和型搭配严重野生型（mt:CoIT301Smt:ND2del1组合型）中，我们没有检测到任何分离偏倚。我们得出4a者生在某些特定阶段。当mt:CoIT300I和mt:ND2del1组合型果蝇在不用将更加明显，即使这种转移延幼虫阶段（图表4b）。因为胚胎4a为了更明确胚胎选择的时间点年轻的雌性异质系果蝇从22℃转移到29℃，在后续每天收集并且评估它们当中温度敏感的降值发生在温度转变的6（图4c），此后丰度的减少将很难的在一个世代中明显观察到（图表3b）。29℃下发生需要大约6色素氧化酶的活性，CoI的产物能在温度转变后保持一段时间，我们29下细胞色素氧化酶的活性在温度敏感型突变体中逐渐下降将幼虫转移到29℃下时，它们早期的后代出现了选择（图表4b）发生在地2到4天其中第3天有50%的发生了选（图表4d选择发生在这两天之内，并且截至第3天，至少50%的发生了选成为优质细胞。以下3种机制能有助于线粒体的传代：在胚质中parkin蛋白参与变异型线粒体的剔除。在park被RNA干扰技术发生的过程是线粒体大量增殖的过程黑腹果蝇的大是正常细胞的100,000倍，因此它含有1千万个线粒体组。有数方方法和任何相关的资料都可以在此文的网上区获得注意任何补充信息和数据文件都可以在此文的网上区获得感我们感谢D.Martinez，因为他帮助我们park 我们同时感谢G.Mardon(BaylorCollegeofMedicine)，因为他为我们提供了dpkΔ21菌株。感谢国立卫生对本项研究的支持联合线粒体疾病对成员P.H.O的支持以及人类前沿科学计划对成员H.作者的贡相关试剂，H.M.P.H.O.编辑了手稿。竞争性金融利作者没有竞争性金融利益重印和权限信息 网上补充信实验对象：本次研究使用的同质系果蝇包括以下变异型：作为野生型对照组。其它变异型包括parkRNAi型，park1型和dpkΔ21型。所有果蝇培养在18-25℃环境下。异质系果蝇的代1:1混合的所得液28-9（从胚胎前端向后端插入针状管18℃2天，之后转移到22℃下培养直至羽化。实10-3050异质系果蝇名原则是前者是供体型后者是受体基oIR301/2del1型果蝇的供体胚型是IR301，受体胚型是D2del1。表格2列举了本次研究的异质系果蝇的型。DNA分组的DNA来自亲本将果蝇置于含有100ul缓冲液的塑料杵中（缓冲液由100mMTris-HCl[pH8.8]，0.5mMEDTA1%SDS成）。将匀浆置于65℃下30分钟，加入醋酸钾（到1M），样本置于冰中30分钟直至出现SDS-蛋白质沉淀。接着，在4℃20000转速下将匀浆离心15分钟接着加入一半体积的异丙醇再次离心室温，20000转速，5分钟后DNA被分离在上清液。所得颗粒再用70%的乙醇，一一保存于100ul的双蒸馏水中。每个雌性果蝇的线粒体基因型的累计频率是单独分开记录的借助实时定量PCR技术统计其F1代和代数的型。对于每一代，我们选取30-50个进行DNA分离。实时定量PCR参在进行反义PCR验时，将SensiFastSYBRGreenPCRMasterMix和400nM的引物混合成20ul进行反应。为了统计异质系果蝇的全部的线粒体组拷贝数，我们对出现在所有组的特殊52个碱基对序列进行实时测量（引物mt702-mt753;补充表格4）。为了统计携带有野生型的mt:ND2del1型（或者mt:ND2ins）的组的拷贝数，我们对特殊51个碱基对序列进行实时测量（引物mt774F和引物mt824R（野生型）或者mt821R（mt:ND2ins）；补充表格4）。用由普通序列和上述mt:ND2del1的野生型序列（或者mt:ND2ins）组成的线性质粒十倍稀释（从51065102来制作标准曲线。应条件：95℃下10分钟，每595℃额每548℃的40组转换。对于每次20ul的实时定量PCR反应而言，每只果蝇的全组的1%被用于模板。携带有野生型的mt:ND2del1型的百分比，其阈值在14-34间。一部分未被处理的异质系果蝇在第一天和mt:ND2del1型雄配在25℃下11（当供体胚是野生型或者mt:ND2ins+mt:CoIsil型时，或者22℃下14.5天（当供体胚是mt:CoIT300I型时）交配中的果蝇每2-3天被转移到新培养瓶。接着，用实时定量PCR技术测量母本线粒体中的供体组的比例。对于可能产生大量异质系后代的母本，们实时定量了那些含有1.0%-3.%供体组的母本的确切比例得到供体组含量低于0.25%的后代进一步用PCR技术和凝胶电泳进行分析这种含量检测特异性比更能使标准PCR的背景低于实时定量PCR技术。经过30PCR能检测含有低于0.012%的野生型ND2del1（或者:ND2in的组因为每一组分立的单元数据都低于1000，所以任何后代中野生型组的比例都将高于0.1PCR能检测到0.01我们坚信我们并没有遗漏任何一个同质系PCR技术帮助我们确定不含供体胚组的后代并且识别出在实时定量PCR含有背景信号却缺乏供体胚组的后代平均值方差和母本组的可遗元的计算都是基于来自同一培养小瓶的单个后代的监测数据的。122℃下14.5内，mt:CoIT300I+mt:ND2del1型母本产生了329后对于第一个瓶子中的早期后代（补充表格5）。质系母本含有两种线粒体组，A和B，那么选择A的可能性直由它的丰度决定，例如，pA=[A]/([A]+[B])和pB=1−pA此，如果每一个后代选择N个母本组的可遗元（可能是组A概率P0为 P=(1-p 整理得 N=- 进行计算出N。值得注意的是，方差V可以这样计算V=pA(1-整理得 N=pA(1- 因为实验数据从Poission分布，所以这两种计算方法所得的N存在差异。N是根据（1）和（2）计算所得，补充表格3列举的是这两种方法所得数值的对比。Vn=pA(1-pA)(1-(1- Vn是第N代的方差。如果次数（kn）可以孤立地考虑，那Nd就可以计算因为次数只能简单估测每次中型的分测Ncd。正因如此，估值列在附加材料中（补充表格3）。7-9体组。所以，我们从第7次之后开始，计算羽化后第一天的假设Ncd保持不变，我们可以计算与所观察到的数据相对应的细胞分裂次数（补充表格3）。计算结果和预期结果吻合。测定各代中标记线粒体组的比为了建立异质系，出现的第一个异质型雌性和mt:ND2del1雄配两天，环境25℃（同时，mt:ND2ins+mt:CoIsil，mt:CoIR301Q，的全组被提取出来供体组的比例通过qPCR技术进定。后代在25℃的环境下生存，每一代的30-50个的组被提取出来并进行qPCR测。mt:ND2del1/mt:CoIT300I+mt:ND2del1异质系一个异质系雌性和mt:ND2del1雄配2天，环境是22℃。下一代被培养在22℃下，然后转换到29℃下一直培养多代供体组的比例的测定和上述方温度转换实被培养在22℃下的I/2del1型雌性来自含有大量II型的她们和mt:ND2d1雄配之后用于检测II组的丰度。我们聚焦于含量高丰度的II的雌性。每一个该雌性24小时内产的都被收集，并且被培养在29天开始收集，第二天的被用于。这一实验也用于par1/dpkΔ1异质系和被敲除park的雌性。22℃）和mt:ND2del1雄配，22℃，之后转换为29℃。12天后排出的（大约第二个生成期）被收集来检测mt:CoIT300I丰度。和mt:ND2del1雄配，22℃，12-16小时后转换到29℃，1-7天后转换到22℃。同样最后检测mt:CoIT300I丰度。对生殖系的干细胞竞争进行的分（mt:CoIT300I/mt:ND2del129℃22℃， 在接下来的10天（超过一个发生过程的时间）用于基于限制性片段的关于线粒体型的数量分系的10或18代30个成熟。每个线粒体组系列（mt1579-用XhoI来消化PCR物。消化之后的DNA段用凝胶电泳进行分离，利用染色的方法统计被剪切的和未被剪切的DNA比例，也可以用Southern杂交以获得更精确的比例。Southern杂交而言，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离消化后的DNA（在探针区域未被剪切再通过毛细管转移到N+尼龙膜上。转膜后的DNA被用紫外线交联法进行固定这些DNA位点和PCR产生的区段杂交，这些区段不被DIG-11-dUTP标记的剪切位点（按使用说明，正确使用0.35mMDIG-11-dUTP，1.65mMdTTPBiolineVelocityDNA聚合酶）。在DIGEasyHybbuffersolution中，预杂交和杂交在41℃下进行。尼龙膜需要用2SSC0.1%SDS室温下分钟内2-3次，用0.1×SSC+0.1%SDS在65℃下15分钟内2按照制造商的使用说明，可以用NBT/BCI对杂交膜进行显用于DIG标记的探针和放大携带XhoI剪切位点的区域所mtDNA前体的序列，附于补充表格4。爬坡测试如ref.13中所述。对于每个测试，将生存了2-3天30个果蝇转移到一个22厘米长、口径1.5厘米的塑料圆筒里，这圆筒从底部往上10厘米处有一个标记线。适应1个小时之后，需要（下一页附此文的及其图注图表1mt:ND2del1的线粒体组的稳定遗（a）BglII和XhoI位点的变异（黄色部分）黑腹果蝇的线粒体包含一个在mt:ND2和mt:CoI的BglII和XhoI位点；当mt:ND2del1序列作为模板时，以mt:ND2作为引物的PCR物中没有野生型。