毛细管电泳非接触式电导分离检测食品中天然甜味剂

毛细管电泳非接触式电导分离检测食品中天然甜味剂第1页/共45页内容概要实验部分2实验总结4机理探讨3前言1第2页/共45页人工合成甜味剂天然甜味剂甜味剂蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蜂蜜、甜菊苷等阿斯巴甜、糖精、甜蜜素、帕拉金糖、安赛蜜、纽甜等据一报道称，2003年9月下旬，我国出口到日本的速冻类、酱菜类、罐头类等食品皆因甜蜜素问题受阻。有专家则认为，甜蜜素是一种无营养甜味剂，有致癌、致畸、损害肾功能等副作用，有的发达国家已全面禁止在食品中使用甜蜜素。我国对糖精钠、甜蜜素、安赛蜜的使用量有限制，且在婴幼儿产品中禁止使用糖精钠！课题背景第3页/共45页“零度”(ZERO)可口可乐——用阿斯巴甜代糖取代天然甜味剂，使其虽然无糖却有甜味。近日，这种可乐受到广泛的争议。每100mL“零度”可乐含只含0.3kCal的热量，而普通可乐45kCal/mL。“零度”可口可乐真的不含有天然甜味剂吗？课题背景第4页/共45页仁果类(苹果、梨)以果糖为主，蔗糖、葡萄糖次之

核果类(桃、杏)以蔗糖为主，葡萄糖、果糖次之

浆果类(葡萄、草莓、猕猴桃)葡萄糖和果糖

柑桔以蔗糖多

各种水果中所含糖的种类是不一样的对糖尿病人更适宜比葡萄糖易于吸收、利用果糖由于口腔的细菌将食物中的蔗糖成份转换成酸，从而侵蚀牙齿的珐琅质

蔗糖导致蛀牙课题背景第5页/共45页

糖的检测难度大，是分析化学界公认的难题：（4）化学结构非常相似，异构体很多分离困难

（1）熄灭系数很低很难直接荧光检测（3）不易挥发

很难用气相色谱(GC)直接分析（2）极性极强，亲水

很难用传统的反相HPLC或SFC(超临界流体色谱)直接分析，而必须借助于衍生课题背景第6页/共45页目前检测糖的方法存在的问题：糖类分析存在的困难

很难用传统的反相HPLC直接分析亲水性强，不易挥发结构相似，分离困难

缺乏发色基团，必须借助于衍生很难直接荧光检测课题背景第7页/共45页课题研究的内容

为此，本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触式电导法，建立快速、灵敏和低成本的食品中天然甜味剂的分离分析新方法。第8页/共45页分离分析原理

毛细管电泳是指离子或带电粒子以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上产差异而实现分离的分析技术。是近十几年发展起来的液相分离分析新方法。第9页/共45页非接触式电导检测原理

电容耦合非接触式电导检测（C4D）是近年来发展起来一种新型的电导检测方法。

由于非接触式中电导电极与溶液隔离，避免了因电极与溶液接触而造成的诸多问题，彻底地消除了电极吸附（中毒）的问题，电极寿命长，抗干扰能力强。同时，C4D检测池结构简单，电极容易固定，对毛细管直径没有限制，可使用内径为5μm

的毛细管。正是因为C4D检测具有通用、灵敏、适用性强、重现性好等优点，研制更优性能的C4D检测器及其应用研究成为了当前CE研究中的一个热点。

第10页/共45页非接触式电导检测原理第11页/共45页非接触式电导检测原理第12页/共45页非接触式电导检测仪非接触式/接触式双通道电导检测器的实物图（谢天尧老师课题组研制）第13页/共45页二、实验部分仪器试剂条件确定样品测定第14页/共45页实验仪器CES2008型毛细管电泳仪（谢天尧老师课题组研制）第15页/共45页毛细管电泳数据工作站（软件）第16页/共45页试剂氢氧化钠（广州化学试剂厂）无水磷酸氢二钠（广州化学试剂厂）

十六烷基三甲基溴化铵（上海伯奥生物科技有限公司）

水为超纯水

石英毛细管（25微米内径，365微米外径，有效长度为40厘米）为河北永年色谱器件有限公司生产。第17页/共45页Na2HPO4Na2HPO4

+硼砂NaOHNa2HPO4

+硼砂+CTABNa2HPO4

＋NaOHNaOH＋Na2HPO4

＋CTABNaOH＋Na2HPO4＋CTAB体系基线平稳，信噪比高，分离度和灵敏度最佳。电泳运行液的选择第18页/共45页NaOH浓度的影响√结论：10mmol/LNaOH分离效果好，出峰快。浓度太小，糖被络合得不完全迁移时间提前，峰形宽钝浓度太大时，峰形变得尖锐但基线不稳，分离度也下降考察了NaOH浓度分别为6mmol/L8mmol/L10mmol/L12mmol/L14mmol/L16mmol/L对三种糖的分离情况第19页/共45页Na2HPO4的影响浓度过低时，糖被络合得不够完全，体系的离子强度太小反映在电导上，就会导致信号强度过小，难以检出浓度过高时，过量的负离子会干扰络合离子，体系离子强度过大，会导致基线不稳，同样不利于分离。考察了Na2HPO4浓度分别为1.5mmol/L-----检不出果糖3.5mmol/L-----基线平稳，分离效果较好5.5mmol/L-----基线不平稳，峰形较宽，分离度不好√第20页/共45页电渗流改进剂（CTAB)的影响CTAB是电渗流改向剂。添加CTAB，可以减少电渗流，能在阳极端有效地检测被测组分离子。CTAB的加入量200mol/L为最佳。第21页/共45页12kV结论：电压较低，分离度增大，灵敏度高，但分离时间较长；加大分离电压，可缩短迁移时间，峰形尖锐，但灵敏度降低。因此，本实验选定分离电压为：-12kV。分离电压的确定第22页/共45页进样时间的确定进样时间影响进样量的大小，也是影响分离效果的重要因素。3S5S7S9S11S｝考察了进样时间的影响，结果如下：｝进样太少，达不到检测灵敏度，出峰不明显进样量太大，出现拖峰现象，峰形重叠√分离度最好第23页/共45页分离电压的确定考察了分离电压的影响，结果如下：-6KV-12KV-16KV峰形宽钝，且出峰时间延长出峰较快；体系不稳定，迁移时间提前√第24页/共45页最佳实验条件的确定NaOH10mmol/LNa2HPO43.5mmol/LCTAB0.2mmol/L分离电压-12.0kV进样电压-10.0kV进样时间7s第25页/共45页糖的种类回归方程相关系数线性范围（mmol/L）检测限（mmol/L）果糖葡萄糖蔗糖y=5.8+802.6xy=13.3+877.6xy=6.9+126.5x0.99970.99910.99980.1~50.00.08~30.01.3~90.00.030.020.3线性范围与检测限葡萄糖果糖蔗糖第26页/共45页表2果糖、葡萄糖、蔗糖的重现性测定重现性测定序号123456RSD/%果糖峰高面积果糖迁移时间（min）葡萄糖峰面积葡萄糖迁移时间（min）蔗糖峰面积蔗糖迁移时间（min）4128.33078.53319.04108.33078.63339.04058.12968.43478.94128.32958.53508.74028.22868.43368.64208.13038.53439.01.51.1

2.70.92.41.8第27页/共45页2.3.1“零度”可口可乐样品实际样品测定样品名果糖（g/100mL）葡萄糖（g/100mL）蔗糖（g/100mL）零度可口可乐未检出未检出未检出图8“零度可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图第28页/共45页2.3.2可口可乐样品样品名果糖（g/100mL）葡萄糖（g/100mL）蔗糖（g/100mL）可口可乐1.191.070.75图6“可口可乐”饮料的毛细管电泳谱图1：果糖2：葡萄糖3：蔗糖第29页/共45页2.3.2王老吉样品样品名果糖（g/100mL）葡萄糖（g/100mL）蔗糖（g/100mL）王老吉未检出未检出1.94图7“王老吉”饮料的毛细管电泳谱图1：蔗糖第30页/共45页2.3.2雪碧样品样品名果糖（g/100mL）葡萄糖（g/100mL）蔗糖（g/100mL）雪碧1.351.351.26图9“雪碧”饮料的毛细管电泳谱图1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖第31页/共45页2.3.3荔枝样品样品名果糖g/100g葡萄糖g/100g蔗糖g/100g荔枝未检出11.67.31图11.荔枝样品的毛细管电泳谱图1：果糖；2：葡萄糖第32页/共45页2.3.4葡萄样品样品名果糖（g/100g）葡萄糖（g/100g）蔗糖（g/100g）葡萄2.216.61未检出图12葡萄样品的毛细管电泳谱图1：果糖；2：葡萄糖第33页/共45页2.3.5红苹果样品样品名果糖（g/100g）葡萄糖（g/100g）蔗糖（g/100g）红苹果8.313.50未检出图13苹果样品的毛细管电泳谱图1：果糖峰2：葡萄糖第34页/共45页样品名果糖（g/100g）葡萄糖（g/100g）蔗糖（g/100g）橙子1.122.676.492.3.6橙子样品图14.橙子样品的毛细管电泳谱图1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖第35页/共45页蔗糖：C12H22O11

，非还原性双糖葡萄糖：C6H12O6，多羟基醛类糖

机理探讨果糖：C6H12O6

，多羟基酮类糖第36页/共45页蔗糖、葡萄糖和果糖是中性分子，但在强碱性和络合剂存在的条件下,可以通过与运行液中存在的络合剂作用，以络阴离子形式存在，并采用高效毛细管电泳实现分离分析。果糖机理探讨葡萄糖蔗糖第37页/共45页机理探讨果糖二磷酸钠葡萄糖磷酸钠第38页/共45页糖在碱性条件下络合带电的机理（1）PO42-参与络合，以果糖为例，其反应如下：+2Na2HPO4

→

第39页/共45页2.PO42-参与络合，以葡萄糖为例，其反应如下：+Na2HPO4

→

第40页/共45页不同种类糖上羟基的取向与数量的差异

在强碱性条件下，糖与磷酸根离子结合糖所带电荷量不相等

有效淌度存在差异这种差异足以被毛细管电泳分辨开

第41页/共45页

本文采用高效毛细管电泳-非接触式电导法建立了食品中天然甜味剂（果糖、葡萄糖和蔗糖）的分离检测新方法，具有如下优点：（1）采用含磷酸盐的强碱性电泳运行液，使中性糖分子成为络阴离子而带上负电荷，产生有效淌度差异，这种差异足以被毛细管电泳分辨开。样品无