DB1308T 321-2023 春季萝卜游离小孢子培养技术规程

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DB1308承 德 市 地 方 标 准B108T21023春季萝卜游离小孢子培养技术规程2023-02-25发布 2023-03-01实施承德市市场监督管理局 发布B108T21023前 言本文件按照GT.-200《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由承德市农业农村局归口。本文件起草单位:承德市蔬菜技术推广站、围场满族蒙古族自治县蔬菜环保站、兴隆县工商业联合会。本文件主要起草人：王玉宏、郑鹏婧、姜红玉、姜涛、李兵、刘博、王春红、刘斯超、唐丽丽、卞颖。I春季萝卜游离小孢子培养技术规程范围本文件适用于春季萝卜游离小孢子培养，十字花科蔬菜游离小孢子的培养可参照执行。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GT62 3.1游离小孢子不形成配子的游离状的单核细胞。3.2游离小孢子培养培养条件实验室环境整洁，干净卫生，有温度调节设备，室内温度控制在20℃～27℃。试剂或材料培养用水符合GB/T6682中规定的三级水，除非另有规定，在培养过程中仅使用分析纯试剂，试剂或材料包括：B5（含维生素）；NLN（不含维生素）；) 0.0%；蔗糖；琼脂；萘乙酸；1还原型谷胱甘肽，纯度≥99%；L-谷氨酰胺，纯度≥99%；L-丝氨酸，纯度≥99%；一水吗啉乙磺酸，纯度>99%；乙醇溶液，75%；次氯酸钠溶液，5%；硝酸钙溶液，25%；.3%；g00l；00.1g.25g6.0251.025g.02g、D-生物素.00500l。仪器设备与器具仪器设备超净工作台；立式压力蒸汽灭菌器：压力0.25MPa，温度139℃；生化培养箱；酸碱度测试仪；电子天平：最大称量：220g，实际分度值：0.0001g；000rin00bar；ngr-pump1r～00r；流式细胞仪。器具0l；00l；研钵：6cm；0l；古式漏斗：3.5cm×12cm；00l；一次性培养皿：60mm；石蜡封口膜：4cm×125cm；眼科镊子：10cm；手术刀；3号；长柄镊子：15cm。操作流程培养基配置→超净工作台操作→环境培养→小孢子植株移栽→留种。2操作方法培养基配置B5B5（含维生素0.1g130g1L，H值调至.800l200n4℃保存。B5B5（含维生素0.1g30g7.5定容到1H值调至.800l0l20热灭菌0n℃保存。2LN培养基NN（）.3872l000l、0.1g0.03g、L0.8g、L0.1g130g0.63961pH5.8.2mngr-pump0.22μm4℃保存。超净工作台操作设备消毒将0l0l20℃灭菌0in超净工作台内用5%乙醇全面擦拭一遍。将离心机、酒精灯、0l烧杯、0l试管、研钵、古式漏5/NLN0m0in。准备花蕾1d～32.5mm～3mm0in花蕾消毒先将冲洗干净的花蕾用乙醇表面消毒30s，期间摇动烧杯，烧杯间不要碰撞。然后使用次氯酸钠深度消毒5in使用无菌水清洗5in，期间摇动烧杯，充分清洗，此步骤重复操作3次，烧杯间不要碰撞，完成清洗后用乙醇擦拭台面。研磨花蕾将消毒过的花蕾放于研钵中，倒入B5液体培养基，液面高出花蕾即可，轻敲研钵，使所有花蕾破裂，花粉释放出即可，加入B5液体培养基定容到10ml。3花蕾液过滤将研磨好的0l花蕾液倒入古式漏斗，经00目纱网过滤后，移至0l离心管，使用离心机000rmn离心3in，倒掉上清液，倒入1l50l，经3次反复操作后，倒掉上清液，得到纯净的花粉母细胞液。分装1l改良2NN0l0个0m5l改良2NLN1l超净工作台注意事项环境培养现胚培养将分装好的培养皿放入生化培养箱中，33℃避光热激24h，后调至25℃避光培养2～3周，即可现胚。再生培养在超净工作台环境下，用眼科镊子将子叶型胚接种至B5固体培养基上。接种后在25℃自然光下培养，三周后子叶型胚发育成幼苗。复壮培养在超净工作台环境下，取出幼苗，手术刀去除叶片和根区，长柄镊子将剩余组织接种到新的B5固53～.1m～.2m小孢子植株移栽5d～74℃～5℃低10d～20d3周后统计成活率，当苗长到4叶1心时达到成苗标准，即可移栽定植。留种档案管