细胞培养基的质量控制定稿

细胞培养基的质量控制定稿第1页，共45页，2023年，2月20日，星期二前言细胞培养基在生物制药领域的应用国内外对细胞培养基的管理细胞培养基的质量控制报告内容第2页，共45页，2023年，2月20日，星期二前言

•细胞培养基从1903年开始发展•最初：天然组织液血液血清组织提取物体液的化学分析•1950年，199培养基•上世纪60年代，设计出无血清培养基第3页，共45页，2023年，2月20日，星期二简单基础培养基–BME(Eagle’s基础培养基)–EMEM(Eagle’s最低必需培养基)–GMEM(Glasgow’s改良Eagle’s培养基)–DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培养基)–RPMI(RoswellParkMemorialInstitute洛斯维公园纪念研究所培养基)第4页，共45页，2023年，2月20日，星期二BME(Eagle’s基础培养基)

•最初为培养mouse‐L和HeLa细胞而设计•在所有合成细胞培养基中使用最广泛的一种•可用于测定正常(WI‐38)和转化(鼠‐L和HeLa)细胞单层的生长反应•BME是Eagle’s最低必需培养基(EMEMorMEM)和Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)的前身第5页，共45页，2023年，2月20日，星期二EMEM(Eagle’s最低必需培养基)

•13种氨基酸•8种维生素•6种离子•可补充血清（提供必要的不明成分）必需氨基酸组氨酸

异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸(和/或

半胱氨酸)苯丙氨酸(和/或

酪氨酸)苏氨酸色氨酸缬氨酸第6页，共45页，2023年，2月20日，星期二GMEM(Glasgow’s改良Eagle’s培养基)

•由lanMacPherson和MichaelStoker发明，以改良EAGLE‘S培养基•该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。•该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。第7页，共45页，2023年，2月20日，星期二DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培养基)

•DMEM最应用最广泛的改良Eagle‘s培养基。•DMEM是由基础Eagle培养基(BME)改良而来，含有4倍浓度的氨酸酸和维生素，以及其它补充成分•最初的DMEM含有1000mg/L的葡萄糖，最初用于培养鼠胚胎细胞•为培养特定细胞，可将葡萄糖浓度优化为4500。RenatoDulbecco,因1955年发明DMEM，于1975年获诺贝尔医学奖第8页，共45页，2023年，2月20日，星期二RPMI

(RoswellParkMemorialInstitute)

•由lanMacPherson和MichaelStoker发明，以改良EAGLE‘S培养基•该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。•该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。第9页，共45页，2023年，2月20日，星期二细胞培养基在生物制药领域的应用细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及生产生物药品的关键原材料之一蛋白药物抗体药物人用疫苗兽用疫苗其它新药研发和科学实验等“培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种”

——Wurm博士，瑞士联邦科技学会生物工艺学教授

——2005，《GeneticEngineeringNews》细胞系/病毒株细胞培养基生物反应器细胞培养技术生物制药核心要素第10页，共45页，2023年，2月20日，星期二细胞培养基在生物制药领域的应用2011年全球生物制药市场销售额为1600亿，占据全球制药份额的19%预计2015年生物制药产品的销售额将超过2400亿生物制药在制药行业比重的增加决定着细胞培养基市场的不断扩大与发展，而生物制药行业的发展趋势也决定着细胞培养基市场的发展趋势。全球利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的普及率到达80%，均使用个性化（或定制）的细胞培养基。个性化配方（属于非公开、商业秘密）的细胞培养基占世界主要细胞培养基制造商销售额的70-90%；无血清无动物来源成分细胞培养有逐渐取代传统的加血清培养方式的趋势第11页，共45页，2023年，2月20日，星期二细胞培养基在生物制药中的重要性细胞培养基实际上就是生物技术产业的一个“菜篮子”工程，只要用到细胞来做生物技术产品就必须要用到细胞培养基。营养丰富的细胞培养基可以缩短细胞生长周期从而缩短生产周期，可以增加细胞密度、增加收获次数、提高表达量，提高生物制品的产量培养基可能给生物制品带来潜在污染，影响产品的分离纯化，关系到生物制品的质量安全第12页，共45页，2023年，2月20日，星期二细胞培养动物疫苗疫苗细胞系疫苗细胞系口蹄疫病毒BHK-21牛副流感病毒3型MDBK猪繁殖与呼吸综合征病毒(中国)Marc-145牛腹泻病毒MDBK猪繁殖与呼吸综合征病毒(美国)MA-104牛呼吸道合胞病毒MDBK狂犬病毒BHK-21牛鼻气管炎病毒MDBK猪流感病毒MDCK犬腺病毒2型MDCK,VERO猪瘟活疫苗（暂行）ST犬细小病毒CrFK,F81猪回肠炎活疫苗（胞内劳森氏菌）McCoy犬瘟热病毒VERO,MA104猪伪狂犬病毒PK(15)犬副流感病毒2型MDCK,Vero猪细小病毒ST,PK(15),IBRS-2狗EHRLICHIA(一种立克次氏体病)DH82马轮状病毒MA104猫瘟病毒CRFK马流感病毒MDCK猫腺病毒2型CRFK东方马脑炎VERO猫白血病病毒FL72西方马脑炎VERO马病毒流产1型4型马皮肤第13页，共45页，2023年，2月20日，星期二FDA对细胞培养基的管理FDA将细胞培养基产品列为医疗器械中的Ⅱ类器械。大多数在美国进行商业销售的医疗器械都是通过上市前通告[510(k)]的形式得到批准的，对Ⅱ类医疗器械产品（占46%左右），实行的是特殊控制，即企业在进行注册和列名后，还需实施GMP和递交510（K）申请。FDAregardsCCMproductastypeIIapparatusinmedicalapparatus,mostmedicalapparatusesforcommercesalesareapprovedbyformofgivingpublicnotice[510(k)]beforetheycomeintothemarket,thetypeIImedicalapparatus(about46%)wasimplementedspecialcontrol,thattosayaftertheenterpriseregistereditstillalsoimplementGMPandsubmit510(K)application.第14页，共45页，2023年，2月20日，星期二欧盟对细胞培养基的管理在欧盟，细胞培养基产品作为一种由多种成分混合组成的物质，必须向欧洲化学品管理局（ECHA）注册，才能获准得进入欧盟市场CCM,onematerialthatcomposedofvariousingredients,mustregisterinECHAcanbequalifiedtoenterintoEuropeanUnionmarket.第15页，共45页，2023年，2月20日，星期二生物制药企业对细胞培养基的要求台湾生物制药企业对细胞培养基生产企业的CGMP稽核依据台湾《药品优良制造规范—原料药作业基准》以及国际医药品稽查协约组织（PIC/S）的规定对细胞培养基厂商进行cGMP稽核，要求多达179项条款国内抗体制药企业向美国申报新药的资料中，对细胞培养基的质量要求：明确细胞培养基组分明确原辅料质量标准现场质量体系稽核报告第16页，共45页，2023年，2月20日，星期二国内细胞培养基行业的现状生产企业国内生产企业：8家左右在华销售的国外企业（包括进口分装）：6家左右生产条件：相差较大市售产品有些产品没有标明组分添加动物来源成分物质某些进口细胞培养基产品无有效期进口分装培养基，分装后未经检验就销售第17页，共45页，2023年，2月20日，星期二缺少相关专业学历或资质的生产和质量管理人员生产环境简陋检验条件不足，不具备细胞培养基产品全部质量指标的检验条件，也不具备对原材料检验的条件和能力无最终混合的批量概念没有实行GMP管理国内细胞培养基生产企业存在的问题第18页，共45页，2023年，2月20日，星期二没有实现行业管理目前，培养基即不属于药品，也不属于按药品管理的辅料，国家对细胞培养基没有强制性质量标准，也未列入药品生产管理范畴国内监管存在一定缺失第19页，共45页，2023年，2月20日，星期二动物细胞可以耐受的体外环境的各种成分的范围比较窄（下表），所以对与之相关的培养基的质量有必要进行严格的质量控制。细胞培养基质量控制第20页，共45页，2023年，2月20日，星期二细胞类型不同，采用的培养基类型也有差异一般要求•离子：Na,K,Ca,Mg,Cl,P,磷酸氢根•微量元素：铁，锌，

硒•糖，如葡萄糖•氨基酸•血清;含有激素和促生长因子同时，含抗生素，细胞生长不需要，但用于控制细菌污染此外，多数培养基含有pH指示剂，酚红哺乳动物细胞培养基的基本要求第21页，共45页，2023年，2月20日，星期二一、水二、低分子量营养物质能量来源六碳糖丙酮酸盐和核榶谷氨酰胺营养来源（氨基酸）维生素离子微量元素脂类和磷脂前体核酸（DNA和RNA）前体三、无营养物质抗生素缓冲体系酚红保护剂抗氧化剂还原剂哺乳动物细胞培养基的基本成分第22页，共45页，2023年，2月20日，星期二一、水水质是至关重要的水纯化方法反渗透或蒸馏（去除主要的化学物质）活性炭过滤（有机和无机杂质）离子交换（微量的金属或离子）微孔滤膜（微生物污染）评估水的纯度电阻标准：25◦C时，≥20MΩcm哺乳动物细胞培养基的基本成分第23页，共45页，2023年，2月20日，星期二二、低分子量营养物质1、能量来源6碳糖(5-20mM):除了glucose,也可以为细胞提供半乳糖和果糖等。在大多数细胞的膜上存在的是Glut1单糖转运载体，同时也有一定数量的Glut2,Glut3等，负责转运其他不同种类的单糖，如果添加其他种类的单糖有助于调节glucose的转运速度，降低lactate的生成，维持pH稳态。但是Glut5仅存在于一些特殊种类的细胞上，负责转运Fructose入胞。丙酮酸盐,核榶哺乳动物细胞培养基的基本成分第24页，共45页，2023年，2月20日，星期二谷氨酰胺(1-20mM)，37度的半衰期t1/2=8days，终产物是游离的胺类物质，具有细胞毒性;哺乳动物细胞培养基的基本成分L-Glutamine属于温度敏感性氨基酸，降解迅速第25页，共45页，2023年，2月20日，星期二2、营养来源（氨基酸）主要分为EAA，NEAA哺乳动物细胞培养基的基本成分第26页，共45页，2023年，2月20日，星期二3、维生素

哺乳动物细胞培养基的基本成分维生素包括：第27页，共45页，2023年，2月20日，星期二4、离子

哺乳动物细胞培养基的基本成分几种常见培养基的离子浓度（μM）：第28页，共45页，2023年，2月20日，星期二5、微量元素

哺乳动物细胞培养基的基本成分第29页，共45页，2023年，2月20日，星期二6、脂肪酸

哺乳动物细胞培养基的基本成分无血清脂肪酸添加物组合预混试剂SupplementsSuppliersContentsNuserumCo.LabsSerumformulationreplacementCPSR-1SigmaSerumformulationreplacementCPSR-3SigmaSerumformulationreplacementCDGibcoMixtureofdefinedformulationoffattyacidLipidConsKabiBitrumInc.MixtureofLipidsLipidMix-1NeuronbcInc.MixtureoffattyacidLipidMix-2NeuronbcInc.Mixtureoffattyacid第30页，共45页，2023年，2月20日，星期二7、核酸

哺乳动物细胞培养基的基本成分通常不是基础培养基的必需成分当叶酸不足时，可添加嘌呤和胸苷第31页，共45页，2023年，2月20日，星期二三、无营养物质1、抗生素细胞生长不需要，但用于控制细菌污染2、缓冲液一般采用碳酸氢根（HCO3‐），与培养环境中的CO2（5－10%）共同形成缓冲体系哺乳动物细胞培养基的基本成分第32页，共45页，2023年，2月20日，星期二2、缓冲液通常会向培养基中添加有机缓冲剂HEPES（pH7.0）哺乳动物细胞培养基的基本成分第33页，共45页，2023年，2月20日，星期二2、缓冲液哺乳动物细胞培养基的基本成分培养液pH值与培养环境中CO2压力的关系第34页，共45页，2023年，2月20日，星期二3、酚红用作pH指示剂会干扰纯化哺乳动物细胞培养基的基本成分第35页，共45页，2023年，2月20日，星期二4、抗剪切力保护系统

哺乳动物细胞培养基的基本成分第36页，共45页，2023年，2月20日，星期二5、抗氧化保护剂

哺乳动物细胞培养基的基本成分6、还原剂

第37页，共45页，2023年，2月20日，星期二国家化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基》（HG/T3935-2007）中的七项检验指标:细胞培养基质量指标及检测方法干燥减重的质量分数≤5％Dryingloseweight≤5％pH渗透压osmoticpressure微生物限度:Microbiallimit

细菌≤200CFU/gbacterium≤200CFU/g霉菌≤50CFU/gMould≤50CFU/g内毒素＜10EU/mlEndomycin＜10EU/ml

细胞生长Cellgrowth澄清度Clarity细胞培养基CellCultureMedium第38页，共45页，2023年，2月20日，星期二哺乳细胞无血清培养基应符合以下技术要求项目指标澄清度澄清pH值（每升标示量/L）3.0~7.0干燥减重的质量分数（%）≤5.0渗透压（mOsm/kgH2O）225~290细菌内毒素（EU/ml）≤10微生物限度细菌数（CFU/g）≤200霉菌数（CFU/g）≤50细胞生长试验细胞形态正常细胞生长试验合格

细胞培养基质量指标及检测方法第39页，共45页，2023年，2月20日，星期二考虑到生物制品的质量和安全性对细胞培养基这种原材料的要求，个人认为，若条件许可，应增加了对细胞培养基中支原体污染、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测。细胞培养基质量指标及检测方法第40页，共45页，2023年，2月20日，星期二1、澄清度检查称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IXB澄清度检查法进行。2、pH值的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录VIHpH值测定法进行。3、干燥减重的测定中华人民共和国药典2010版二部附录VIIIL干燥失重测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。细胞培养基质量指标及检测方法第41页，共45页，2023年，2月20日，星期二4、渗透压的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IXG渗透压摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。5、细菌内毒素的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XIE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检查用水（市售）10ml溶解，吸取该溶液0.1ml加细菌内毒素检查用水（市售）3.9ml，混匀即得试验溶液。细胞培养基质量指标及检测方法第42页，共45页，2023年，2月20日，星期二6、微生物限度的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XIJ微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。称取实验室样品1g，精确至0.0