【课件】高三生物一轮复习课件微专题-PCR技术

微专题——PCR相关问题分析一、PCR技术原理:DNA双链复制DNA聚合酶引物解旋酶移动方向聚合酶移动方向聚合酶移动方向子链延伸方向5’→3’双链DNA4种dNTP模板和原料二、PCR技术中所需要的条件特异性两种引物一定的缓冲溶液温控设备其他条件Taq酶（热稳定DNA聚合酶）酶思考：根据下图判断需要知道目的基因的哪一端核苷酸序列？引物Ⅰ3’端5’端5’端3’端引物的3’端DNA聚合酶DNA母链新合成的DNA子链根据目的基因的3’端的部分核苷酸序列合成引物思考：PCR过程中利用dNTP作为原料有何优点？既可以作为原料，也可以为DNA合成提供能量请为下列目的基因选择引物序列，并说出子链延伸的方向。例题：引物2：←引物3：→PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。关于PCR引物设计原则扩增特异性扩增高效性引物①引物长度要适宜，通常为20-30个核苷酸②引物GC含量要适宜，一般为45-55%③退火温度要适宜④引物自身及引物之间不应存在互补序列⑤引物5'端可以修饰，3'端不可修饰发夹结构二聚体（1）从水生栖热菌（生存环境温度可高达80℃)中分离出来具有热稳定的DNA聚合酶。（2）作用原理：将脱氧核苷酸连接到引物的3’端，形成磷酸二酯键。（3）真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应缓冲液中一般要加Mg2+。关于Taq酶（热稳定DNA聚合酶）DNA双链模板引物4种脱氧核苷酸变性退火延伸循环94℃55℃72℃三、PCR技术的过程思考：左图a表示

，目的是

。解旋是通过

实现的。预变性让长链DNA充分变性94℃高温思考1：PCR过程中与细胞内的DNA复制有何不同？思考2：如果变性温度过低会出现什么结果？思考3：如果复性温度过高会出现什么结果？思考4：如果复性温度过低会出现什么结果？思考5：如果延伸时间过长会出现什么结果？DNA双链解旋不完全不利于引物与模板的结合，导致PCR过程没有产物非特异性扩增产物增多引物会与模板的结合位点增加，非特异性扩增产物增多例题：PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种成分的优化组合，相关叙述错误的是

A.反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否

B.设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和GC含量

C.Taq酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物量的增多

D.目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置√四、PCR扩增过程中的数量问题思考：根据上图在第几次PCR循环过程中出现等长的DNA？第3次循环次数123nDNA分子数2__________含引物A(或B)的DNA分子数1_____________同时含引物A、B的DNA分子数0＝21－2____________________________共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－2________

等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－6DNA分子种类482n2n－12n－26＝23－22＝22－2372n－2n24552n+1－21、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量取液器用于定量转移PCR配方中的液体实质上是能够自动调控温度的仪器五、PCR的实验操作不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头。每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换。总体积为20uL、30uL或100uL等（二）配制反应体系将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（三）设置PCR反应程序（四）DNA的电泳鉴定微量取液器电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移,越小的DNA片段距离出发点越远.1234561.Marker：标准大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循环次数的PCR产物6：清水缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。开展电泳鉴定实验时，采用凝胶成像仪或紫外线投射仪观察和记录结果例题：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高

压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的

枪头都必须更换√六、PCR的应用（一）（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。；RT表示逆转录（reversetranscription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA（图1）。2019-nCoV核酸检测优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。下图显示了相关原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。例题：“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答：(1)结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________酶、_____________酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的_________、____________有关。跟踪训练逆转录TaqDNA聚合引物TaqMan探针(2)根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据________________________________________________________________________。新冠病毒(2019－nCoV)是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病新冠病毒RNA内部的一段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出2019－nCoV特有序列，以避免________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。假阳性(3)根据图1和图2，TaqDNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能________________________________。催化RNA(TaqMan探针)的水解(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与__________、_______________________________________________有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得扩增次数样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA含量)到一条荧光扩增曲线图(如图)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中____________________________________________等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。原料、引物和探针数量(或TaqDNA聚合酶活性)(5)虽然荧光RT—PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有_____(填字母)。a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染c.病毒相应关键序列发生了基因突变abc六、PCR的应用（二）重叠延伸PCR重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基因中核苷酸序列(或基因片段)设计出多对具有互补末端的引物，先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源的扩增片段重叠拼接起来的目的。第一步：分别用引物1和引物2、引物3和引物4在两个不同PCR体系中扩增获得外显子A和外显子B的DNA片段。为了实现⑤过程的搭桥，所以引物2和引物3之间存在部分碱基互补配对情况，所以②过程必须在两个不同PCR体系中进行。第二步：⑤过程中两个DNA片段存在部分序列同源，在PCR变性过程中解旋互为模板，然后延伸得到外显子A和外显子B拼接而成的DNA片段。第三步：再用引物1和引物4进行PCR扩增增加产物。例题：重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的基因(如图1蛋白A基因)的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物(图1中的引物A→D)，其中引物A、D是通用引物，引物B、C中都替换了一个碱基。图2表示4次PCR扩增。请据图回答：（1）图1中引物A、D设计的依据是