实验一提取方法及原理

实验一提取方法及原理第1页，共28页，2023年，2月20日，星期六一、研究背景二、方法及原理第2页，共28页，2023年，2月20日，星期六一、研究背景1.RNA研究的重要性

DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。第3页，共28页，2023年，2月20日，星期六2RNA分布不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mg第4页，共28页，2023年，2月20日，星期六二、方法及原理1、RNA的提取流程

（1）样本前处理（2）细胞裂解（3）RNA的纯化及获得第5页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA提取流程－－样品前处理注意点

选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织第6页，共28页，2023年，2月20日，星期六可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本第7页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒第8页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA提取流程－－

RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染第9页，共28页，2023年，2月20日，星期六2.RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染a.严格戴好口罩，手套。b.实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。第10页，共28页，2023年，2月20日，星期六阻止内源酶的活性a.选择合适的匀浆方法。b.选择合适的裂解液。c.控制好样品的起始量。第11页，共28页，2023年，2月20日，星期六明确自己的抽提目的a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。b.RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

第12页，共28页，2023年，2月20日，星期六Rnase污染的10大来源

1：手指头2：枪头3：水/缓冲液

4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶第13页，共28页，2023年，2月20日，星期六复习核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取细胞破碎→匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）；DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂第14页，共28页，2023年，2月20日，星期六复习核酸的提取方法

DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到DNA、Pro第15页，共28页，2023年，2月20日，星期六复习核酸的提取方法核酸的沉淀DNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5.收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第16页，共28页，2023年，2月20日，星期六Trizol

试剂提RNA的原理Trizol

试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第17页，共28页，2023年，2月20日，星期六

TRIzol法提取流程1.样品处理：

组织：取100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆，匀浆液转1.5ml离心管中,室温静置５min。2.加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3.4℃离心，13000g×15min，取上清。4.加入与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液体轻轻混匀，室温静置20min(-20℃，时间长效果更好)。

取200-300ul从5步往下做。第18页，共28页，2023年，2月20日，星期六TRIzol法提取流程5.4℃离心，13000g×10min，弃上清。6.加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打碎。4℃，13000g×5min，弃上清。7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎)8.晾干，加入适量的H2O溶解（100ul）（65℃促溶10-15min）。9.定量。第19页，共28页，2023年，2月20日，星期六细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验流程图细胞选择贴壁细胞悬浮细胞第20页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA提取常见问题RNA的降解

OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳第21页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA降解

新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。第22页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。第23页，共28页，2023年，2月20日，星期六OD260/OD280

比值偏低

蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第24页，共28页，2023年，2月20日，星期六OD260/OD280

比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。第25页，共28页，2023年，2月20日，星期六电泳带型异常

非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。第26页，共28页，2023年，2月20日，星期六下游实验效果不佳

RNA降解

抽提试剂的残留

75%乙醇洗涤

样品中杂质的残留

多糖等杂质，再次沉淀DNA污染

使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA第27页，共28页，2023年，2月20日，星期六RNA的保存短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmol／LTris，1mmol／LEDTA)或无：RNA酶水(0.1mmol／LEDTA)中，保存于一20℃。在保存RNA样品时，通常使用EDTA来螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，许多实验室配制EDTA后常使用很长时间甚至数年，这种长期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而会造成RNA酶的污染。中长期保存：相对于一20℃，一80℃可进一步防止RNA降解。可将RNA溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中