免疫组化试题参考答案-2023修改整理

千里之行，始于足下让知识带有温度。第第2页/共2页精品文档推荐免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：

1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。

2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。其原理是组织用1NHCl60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。

3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。

4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。无标记的探针称裸探针。

5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。

6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。

7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。此技术目前主要应用在生物胺的显示中。其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。

8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。此法是阳性结果的进一步检测和分析，越发直观地反应试验结果，更有力地说明试验结果。常用有人工定量分析与仪器定量分析两类。

9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有须要对细胞和组织举行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原改变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。

10.组织化学：指在形态学基础上讨论组织或细胞中物质的化学成分和活性，并举行定性、定位、定量及其代谢状态的学科。其目的是联系形态、化学万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。

11.ABC法：即亲和素-生物素-过氧化物酶复合物

法，其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共价和不行逆的结合，通过抗生物素在辣根过氧化物酶和其次抗体之间建立生物素桥联，使酶定位于所需测定的特异性抗体周围。其优点在于易于找到合适的其次抗体。

12.细胞骨架：指细胞内的结构网架，由一些细丝成分组成，包括微丝、微管、中间丝和微梁网格。

二、问答题

1.简述酶组织化学的基本原理。

答：在酶组织细胞化学办法中，从原理上讲，可分为两在类型。一类是酶是活性——酶组织细胞化学办法，属于普通组织细胞化学办法。一类是酶蛋白质的存在及存在的部位——免疫酶组织细胞化学办法，属于免疫组织细胞化学的内容。目前，通常是将两者结合起来，即显示酶活性，又酶蛋白的存在、分布及代谢状况。

2.用箭头表示免疫电镜技术（包埋前法）的过程。答：包埋前法有用于酶标法和PAP法。详细过程如下：取材→→固定→→冰冻切片（40~150μm）→→免疫染色（同酶标法和PAP法）→→挑选阳性部位，在解剖显微镜下，取下阳性部位，裱于盖玻片上→→1%的锇酸固定，1~1.5h→→脱水→→平板包埋聚合→→修块、超薄切片（50~80nm）、裱于铜网→→重金属盐双重染色→→电镜观看、记录、照片。

3.简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。

答：此过程包括：⑴杂交前预备：取材和固定→玻片及盖片的处理（粘附剂的使用）→器皿处理和溶液配制容器的处理→增强组织的通透性和核酸探针的穿透性→减低背景染色→防止RNA酶的污染；⑵杂交过程（杂交反应）：包括变性与杂交；⑶杂交后处理①冲洗：用一系列浓度不同的和温度不等的平衡盐液冲洗（普通原则是盐液的浓度由高到低，温度由低到高），并在冲洗的过程中防止切片干燥；②RNA酶消化处理：仅使用于RNA杂交。

⑷显示/杂交体的检测：①同位素标记者：用发射自显影技术显示。②非同位素标记者：应挑选相应的方式显示。⑸对比试验：按照核酸探针和靶核苷酸的种类在现有可能条件下选定。

4.组织化学质量控制有哪些办法？

答：组织化学质量控制的办法有：⑴试验过程的质量控制：①试剂的质量控制，包括：试剂的特异性和敏感性；最佳的稀释度；在已知阳性和阴性的标本上，观看其染色结果的复合状况；要确定染色的温度和时光；保存的时光和有效期的时光。②操作步骤的质量控制，包括：组织标本制备的质量控制；操作过程各环节的质量控制a.各种溶液的浓度、成分、PH值的控制，容器的质量标准。b.特别试剂的配制：c.步骤中间环节的控制；⑵背景染色的控制①疏水作用②离子作用—电荷作用③内原性酶活性作用④抗体污染或/抗体纯度不高⑤内原性抗生物素/生物素蛋白结合活性⑥抗原的蔓延⑦交差反应⑧其它缘由。

5.比较PAP法和ABC法的异同。

PAPABC敏捷性低（1倍）高（20倍）

特异性高更高

背景普通有背景普通很少或无背景

复合物特点PAP复合物

只用于PAP法，且抗体与一抗的种族相同

ABC复合物

用途广，可通用，用生物素标记的均可

用途免疫组织化学（IHC）IHC、ELISA、原位杂交

6.简述PAP法的过程。

答：⑴处理切片，封闭内源性物质和避开交错反应；

⑵抗孵育切片，湿室，37℃，30-60分钟；⑶PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑷2抗孵育切片，湿室，室温，37℃，30-60分钟；⑸PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑹加入PAP复合物，孵育30分钟；⑺PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑻染色0.01～0.02%H2O2+0.01～0.05%DAB+0.05～

0.10UMTris-Hcl(PH7.40)室温，3-5分钟，避光；

⑼漂洗，双蒸馏水洗涤；⑽复染；⑾漂洗，双蒸馏水洗涤；⑿脱水、透亮     、封片；⒀光镜观看，记录。

7.定量分析有哪些办法？

答：⑴人工定量分析；⑵仪器定量分析：①显微荧光分光光度计；②显微分光光度计/仪；③显微图像分析仪：灰度、长度、周边、面积、曲线长等；

④流式细胞计数仪；⑤激光扫描共聚焦显微镜技术。

8.增加组织化学染色的办法有哪些？

答：⑴酶消化在抗原裸露中的作用：①胃蛋白酶：0.4%、37℃、20～30分钟。②胰蛋白酶：0.1%、37℃、5～40分钟。③链霉蛋白酶：0.06%、室温、10分钟。⑵微波炉处理在裸露抗原中的作用：其原理在于通过微波管放射较高频率的电磁波而使组织内部的分子发生高速振荡，使组织温度上升，同时加速分子交联，促使组织中抗原打算簇裸露。步骤：脱蜡、水化的标本微波处理10～20分钟，功率600W→室温冷却15分钟以上→常规免疫细胞化学染色。⑶不同抗原组织预备办法的检测：主要在固定办法和固定剂上存在差异。①细胞外和基底膜相关蛋白抗原：交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀类固定剂乙醇。②细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白：首选蛋白沉淀类固定剂乙醇。③胞浆酶和胞浆激素：醛类固定剂。④各类组织和细胞抗原：低浓度的多聚甲醛4-5h（4℃）固定后直接举行冰冻切片。

9.简述结果的推断的类型及意义。

答：结果的推断类型：⑴定性推断，即试验结果然实性推断；⑵定位推断，即结果浮现的部位确实定，可以帮助定性推断；⑶定量推断是结果推断中最重要也最具故意义的推断。意义：试验结果的推断直接关系着试验的成败，因此，结果推断是囫囵试验工作的核心和结论，必需是真切的结果，特殊是一些试验结果与前人或与其它文献报道差异较大时，作出结果推断时应特殊慎重。

10.简述核酸原位杂交技术的特点。

答：核酸原位杂交技术的特点如下：①特异性与敏感性高。②在组织细胞内定位可检测的靶序列。③能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。④可完好的保存组织与细胞的形态结构。⑤不需要从组织细胞中提取核酸，避开了抽提中核酸量的损失。

⑥对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列。⑦可用于讨论个别细胞中的核酸，而不受组织中其他细胞的影响。⑧不需要破碎细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。

11.用箭头表示石蜡切片技术的步骤。

答：石蜡切片技术步骤：①取材→②固定→③脱水→④透亮     →⑤浸蜡→⑥包埋→⑦切片。

12.简述免疫组织细胞化学技术的全过程。

答：免疫组织细胞化学技术全过程：抗原提取和纯化→→免疫动物→→抗体的分别、提取、纯化和效价确实定→→标记抗体→→标本制备→→免疫反应过程→→观看及结果推断与分析。

13.常见的免疫组织化学办法有哪些？

答：常见的免疫组织化学办法：①免疫荧光组织/细胞化学技术；②免疫酶标组织/细胞化学技术；

③过氧化物酶一抗过氧化物酶法（PAP法）；④抗

生物素—生物素复合技术（ABC法）；⑤SPA免疫组织/细胞化学技术；⑥免疫电镜技术。

14.影响核酸杂交的因素有哪些？

答：影响核酸杂交的因素：①核酸分子的浓度和长度：核酸浓度大，单链核酸间的碰撞几率大，复性几率大。单链探针浓度越大，杂交效率高，但双链探针浓度过高会影响杂交的效率。②温度：温度过高不利于核酸的复性，温度过低不利于少数碱基配对形成的局部双链分别。③离子强度：离子强度低，杂交速度慢，随着离子强度增高杂交反应率增强。

④杂交液中的甲酰胺：甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基积累力和氢键的形成，因此可减低核酸杂交的Tm。⑤核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同挨次的总长度，复杂性越高，形成正确配对难度越大，反应速度越慢。⑥非特异性杂交反应：为削减非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点举行封闭，以削减对探针的非特异性吸附作用。

15.简述核酸分子原位杂交的基本原理。

答：核酸分子杂交是依据DNA双链碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列的办法。即双链核酸分子（DNA双链）分子分解为单链—变性（采纳加热/提PH值来实现）→→杂交后单链聚合为双链—退火/复性。

16.简述组织化学的基本要求。

答：组织化学的基本要求：①保持组织细胞良好的形态结构。②具备高度的特异性。③应有一定的敏捷性。④可重复性。⑤生物反映的产物必需在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。

17.简述免疫组化在人体讨论中的主要用途。

答：免疫组化在人体讨论中的主要用途：㈠免疫组化在肿瘤病理学的讨论和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的讨论；（2）讨论病原体与肿瘤的关系；（3）帮助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗计划提供依据。㈡免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的应用；㈢免疫性皮肤疾病在诊断中的应用。

三、填空题

1.影响酶催化反应的因素是酶浓度、底物浓度、激活剂浓度、抑制剂浓度、PH值、温度。

2.核酸杂交的普通步骤是待测核酸的制备与变性→探针的制备及标记→固相支持物的挑选与处理→预杂交、杂交、漂洗→检测显示杂交信号→结果的推断分析。

3.增加特异免疫染色的办法有①蛋白酶消化法②合适的抗体稀释液③温育的时光长短30~60℃4℃过夜④多层染色，提高敏感度。

4.常用的固定剂是醛类、非醛类、金属类。

5.核糖体是核糖核酸和蛋白质组成。

6.抗体常用的标记物有荧光素、酶、抗生物素—生物素—HRP、金属。

7.按照探针的核酸性质分基因组DNA探针，cDNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针四类。

8.仪器定量分析技术有显微荧光分光光度计、显微分光光度计/仪、显微图像分析仪、流式细胞计数仪、激光扫描共聚焦显微镜技术。

9.组织化学的基本要求是保持组织细胞良好的形态结构，具备高度的特异性，应有一定的敏捷性，可重复性，生物反映的产物必需在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。

10.石蜡切片的5大步骤是①取材→②固定→③脱水→④浸蜡、包埋→⑤切片。

11.组化中常用的酶类：辣根过氧化物酶（HRP）、小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶。

12.固定基本原则是组织块要尽量小，固定要准时和适时，挑选合适的固定剂，要注重固定剂的浓度、PH值和温度。

13.固定办法是浸入法和灌注法。

14.免疫组织/细胞化学特点是高度特异性，高度敏感性，办法和过程统一，形态、机能、新陈代谢等生命活动相结合。

15.核酸原位杂交技术的特点是

特异性、敏感性高；可检测的靶序列在组织细胞内定位；能够将组织学表现与基因功能的变化相结合；可完好的保存组织、细胞的形态结构；不需要从组织细胞中提取核酸，避开了抽提中核酸量的损失；对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列；可用于讨论个别细胞中的核酸，而不受组织中其它细胞的影响；不需破碎细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。

16.内质网分粗面内质网和滑面内质网两类。

17.按照试剂或标记物的不同分普通组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、核酸分子原位杂交组织化学四类。

18.核糖体分游离核糖体、附着核糖体、多聚核糖体三类。

19.溶酶体分初级溶酶体、次级溶酶体、残余体三类。

20.细胞骨架是微丝、微管、中间丝和微梁网架组成。

21.确定最适PH的办法是查阅文献，按照前人的阅历，预试验印证和试验测定最适PH值。22.试验过程的质量控制是试剂的质量控制、操作步骤的质量控制、背景染色的控制。

23.在酶组织化学中，按照其反应原则，显示酶的办法，可分为沉淀反应法和电子传递法两大类。

24.辣根过氧化物酶（HRP）显色原有DAB、AEC、CN、H-Y试剂。

25.荧光组织化学分为自发荧光、诱发荧光、荧光染色、免疫荧光、酶促荧光。

26.荧光图象的记录办法有描述法、荧光照相、暴光时光测定法、强弱表示法、显微荧光测定法。27.免疫反应的形成可分致敏阶段、反应阶段和效应阶段三个阶段。

28.PAP法的特点是抗体活性高；敏捷度高；背景染色浅，有利于观看和记录。

29.ABC法的优点是①敏感性强；②特异性强，背景染色浅；③办法容易，节省时光；④ABC试剂盒国内已大量生产，价格适中；⑤生物素具有与多种显示剂结合的能力，可用作双重或多重免疫染色。

30.免疫电镜技术的基本要求是保持超微结构完好，结构不转变；保存最多的抗原及抗原活性。31.免疫电镜技术分铁蛋白标记免疫电镜技术、酶标记免疫电镜技术、PAP法和胶体金免疫电镜技术四类。

32.胶体金免疫电镜技术优点是①金颗粒电子密度高，清楚可辩，形态规章；②办法容易一些，不如PAP法复杂；③同一组试验，可用不同直径的金颗粒可作多种抗原的区分讨论，双标；④金标抗体能发生二次电子，可作用扫描电镜观看。

33.免疫电镜技术包埋后法缺点是①抗原及活性损失大；②部位不准；③得到阳性结果难度大。

四、试验设计题

（一）某试验室拟采纳ABC法讨论缺血性心肌损伤时ANP（ANF）的变化。请设计此课题。

1、预备哪些试剂和药品。

二甲苯；30%H2O2和浓盐酸；ABC免疫复合物试剂；抗大鼠ANP的特异性兔抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常羊血清PBS液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。

2、写出试验的思路或过程。

⑴试验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，试验组（缺血组）10只，对比组10只。

⑵试验组大鼠采纳结扎冠状动脉办法制作缺血性心肌损伤模型，对比组（即假手术组）只裸露冠状动脉但不结扎。

⑶试验过程：①从试验组大鼠心肌损伤组织中按设计好的不同时光点取材（对比组取材部位、时光与试验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min×3次；⑤正常羊血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗ANP37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min×3次；⑦生物素化羊抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS洗3min×3次；⑧加ABC复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时光），自来水终止；○10切片脱水，透亮     封片。

⑷试验组与对比组均按上述试验过程举行。

⑸观看记录结果：浮现棕黄色颗粒即为阳性结果。

⑹将试验组与对比组比较，用统计学办法分析，得出结论。（二）某试验室拟采纳PAP法讨论缺血性脑损伤时NPY的变化。请设计此课题。

1、预备哪些试剂和药品。

二甲苯；30%H2O2和浓盐酸；PAP免疫复合物试剂（来自于兔）；抗大鼠NPY的特异性兔抗体（一抗）；猪抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常猪血清PBS液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。

2、写出试验的思路或过程。

⑴试验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，试验组（缺血组）10只，对比组10只。

⑵试验组大鼠采纳结扎双侧颈总动脉办法制作全脑缺血性动物模型，对比组（即假手术组）只裸露颈总动脉但不结扎。

⑶试验过程：①从试验组大鼠大脑皮质组织中按设计好的不同时光点取材（对比组取材部位、时光与试验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min×3次；⑤正常猪血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗NPY37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min×3次；⑦猪抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS洗3min×3次；⑧加PAP复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时光），自来水终止；○10切片脱水，透亮     封片。

⑷试验组与对比组均按上述试验过程举行。

⑸观看记录结果：浮现棕黄色颗粒即为阳性结果。

⑹将试验组与对比组比较，用统计学办法分析，得出结论。

（三）某试验室拟采纳核酸原位杂交技术讨论缺血性脑损伤时SPmRNA的变化。请设计此课题。1、预备哪些试剂和药品。

二甲苯；30%H2O2和浓盐酸；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）；0.1MPBS(pH7.2)；0.2MPB((pH7.2)；0.1M甘氨酸；4%多聚甲醛；16×Denhardt溶液；预杂交液；20×SSC；抗体稀释液；TSM1；DIGDNA标记检测试剂盒。

2、写出试验的思路或过程。

⑴试验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，试验组（缺血组）10只，对比组10只。⑵试验组大鼠采纳结扎双侧颈总动脉办法制作全脑缺血性动物模型，对比组（即假手术组）只裸露颈总动脉但不结扎。

⑶试验过程：①麻醉大鼠后，用4%多聚甲醛灌流固定后取材，制备冰冻切片。②随机引物制备cDNA核酸探针，并用DIGDNA标记检测试剂盒检测探针敏感性。③预杂交：滴加适量预杂交液，42℃30min。④杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5ng/μl），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。（注重阴性对比）⑤洗片：4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC37℃各洗20min；0.2×SSC37℃洗10min；0.2×SSC与0.1MPBS各半洗10min；0.05MPBS洗5min×2次。⑥3%BSA/0.05MPBS包被，37℃30min.⑦滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。⑧0.05MPBS洗15min×4次;TSM110min×2次;新奇配制TSM210min×2次。⑨显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。⑩将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。⑷试验组与对比组均按上述试验过程举行。⑸观看记录结果：浮现棕黄色颗粒即为阳性结果。

⑹将试验组与对比