纤维素酶专题知识专家讲座

引言纤维素是世界上蕴藏量最丰富天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物经过光合作用合成。据预计，地球纤维素每年经过光合作用更新量约为4.0X1010吨。纤维素是地球上最丰富多糖物质，是植物细胞壁主要组分，占植物秸秆干重l／3～l／2，也是自然界存在最多一类可再生生物聚合物。依赖于人们对纤维素酶发觉和认识。纤维素为一个含有巨大潜力。纤维素酶专题知识专家讲座第1页

全世界农作物秸秆年产量超出20亿吨，仅我国每年秸秆产量就高达7亿吨。因为其中含有大量纤维素，营养价值低，难以被畜禽利用，所以只有极少一部分用作饲料，少许用来过腹还田或直接还田嘲，而大约有45％～47％作为燃料补充农村能源不足，15％以烧荒形式烧掉或丢弃。秸秆直接利用率较低，如不对这类纤维素废物加以有效地利用，不但会严重污染环境，而且也造成资源极大浪费，所以探索纤维素类废弃物处理办法，对其进行有效利用是21世纪重大课题。引言纤维素酶专题知识专家讲座第2页纤维素结构纤维素酶专题知识专家讲座第3页什么是纤维素酶？

纤维素酶：纤维素酶是酶一个，在分解纤维素时起生物催化作用,是多组分酶体系，是含有纤维素降解能力酶总称。按照纤维素降解微生物和纤维素酶系之间关系，可将纤维素酶系分为三类：一是对天然纤维素降解能力比较弱，但可大量合成份泌到胞外纤维素降解酶系，酶组分是游离，如常见木霉、青霉纤维素酶系；二是对天然纤维素降解能力强，但分泌到胞外纤维素酶系活力较低，如担子菌类等；三是对天然纤维素分解能力强，但基本无纤维素酶分泌到胞外，如厌氧细菌纤维素酶系。纤维素酶专题知识专家讲座第4页纤维素酶组成及性质1：外切葡聚糖酶包含两类酶，一类：是β-1，4-D-葡聚糖一葡萄糖水解酶，也称为纤维素糊精酶(Ec3.2.1.74)；二类：酶为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolasesCBH)，即β-1，4-D-葡聚糖一纤维二糖水解酶(exo-B-1，4-D-glucanases，EC3.2.1.91)，简称外切酶。CBH是纤维素酶系中主要组分，在天然纤维素降解过程中起主导作用，能够水解微晶纤维素和棉花等结晶度高纤维素，作用于无定形纤维素非还原末端或还原端，水解β-1，4一糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，生成可溶纤维糊精和纤维二糖。纤维素酶专题知识专家讲座第5页2:内切纤维素酶(endoglueanases，EG)或内切葡聚糖酶，即内切1，4-β—D-葡聚糖q一葡聚糖水解酶(endo-β-glucanasea，EC3.2.1.4)，简称内切酶，也称cx酶，CMC酶。内切纤维素酶随即地水解磷酸膨胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素非定形区，无规则水解β-1，4糖苷键，形成葡萄糖、纤维二糖纤维三糖和不一样大小纤维糊精，为纤维二糖水解酶提供更多可供水解末端。纤维素酶组成及性质纤维素酶专题知识专家讲座第6页3：β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases，β-6或BG)或β-D-葡萄糖苷一葡萄糖水解(EC3.2.1.21)，又称纤维二糖酶(cellobiase，CB)，它主要裂解纤维二糖和从小纤维素糊精非还原末端水解葡萄糖残基，生成葡萄糖产物。它水解速率随底物大小降低而增加，以底物为纤维二糖时水解速率最快咖。严格地讲，β-葡萄糖苷酶不能算作纤维素酶，但它能够减轻纤维二糖对纤维素酶反馈抑制作用。纤维素酶组成及性质纤维素酶专题知识专家讲座第7页纤维素酶理化特征一：分子量不一样起源、不一样组分纤维素酶分子量差异较大，其改变范围很广。当前普遍认为：1.内切酶分子量介于23～146kDa；（但有研究认为）内切酶相对分子量介于23～118kDa(胞内酶)和47～76kDa(胞外酶)。2.真菌EG两种异构酶，EGI分子量约为54kDaEGⅢ分子量约为49.8kDa。3.外切酶分子量介于38～118kDa，木霉属真菌产CBH1分子量约为66kDa，CBHII分子量为53kDa；13—葡萄糖苷酶为90～l00kDa(胞内酶型)和47～76kDa(胞外酶型)。纤维素酶专题知识专家讲座第8页纤维素酶理化特征二：等电点等电点(pI)是蛋白质分子主要理化特征。纤维素酶系中各组分等电点随菌种起源、培养条件改变而异。普通认为，木霉属真菌产CBHIpI值约为4.2，CBHIIpI值约为5.9。真菌EGIpI值约为4.7，EGUIpI值为4.8～5.6(也有报道约为7.47)，BGpI值约为7.5～8.5。纤维素酶专题知识专家讲座第9页纤维素酶理化特征三：最适温度酶反应存在一个最适温度。普通纤维素酶最适温度范围为40—60℃。纤维素酶各组分热稳定性也存在差异，内切酶(Cx)最适温度为50～60℃，热稳定性好，在95℃时仍保留普通酶活性；不一样起源β—葡萄糖苷酶最适温度均为50～60℃。然而有研究报道，β—葡萄糖苷酶含有很高耐温性，在50℃保温60h，仍保持95%以上活性，最适温度为70℃。也有报道，康宁木霉中外切酶(C1)含有特殊热稳定性，其最适温度为40～60℃。纤维素酶专题知识专家讲座第10页纤维素酶理化特征四：纤维素酶最适ph值纤维素酶酶活对环境pH值很敏感，不一样菌种、不一样组分纤维素酶最适pH值有差异。如曲霉、青霉及木霉产生酸性纤维素酶，普通在酸性环境pH4.0～5.0有较高活性。田新玉从200余株嗜碱细菌中筛选到一株产碱性纤维素酶菌株N6227，其酶反应最适pH值为8.5。内切酶(cx)最适pH值为5.0～7.0；C1酶和BG最适pH值为5.0左右，BG在pH值4.0～8.0时稳定。纤维素酶专题知识专家讲座第11页纤维素酶理化特征五：纤维素酶多样性

产纤维素酶微生物普通不会只有一类纤维素酶组分。试验证实，S.pulverhlentum培养液就包含五种内切葡聚糖酶和两种不一样BG。T.emersonii胞外酶包含三种BG、四种cx和五种外切酶。即使只产生一类纤维素酶组分，也往往有各种不一样形式。Elena．S等报道，一个白热担子菌(phanerochaetechrysosporium)依靠碳源，能在细胞外、细胞内和细胞壁上产生三种不一样BG，其对应相对分子量分别为96kDa、98kDa和114kna。同一微生物，也可能因为不一样地域起源、不一样培养条件而使得纤维素酶成份有很大差异，这也是纤维素酶多样性表现。纤维素酶专题知识专家讲座第12页纤维素酶理化特征六：纤维素酶诱导性真菌纤维素酶是诱导酶，在诱导物存在下才能产生。许多不溶性纤维素、可溶性纤维素衍生物、一些低聚糖类以及一些单糖和二糖均可作为纤维素诱导物。Nisizawa研究发觉，纤维素、纤维二糖、槐糖、纤维索衍生物等都能诱导里氏木霉和绿色木霉产生纤维素酶。然而值得注意是，纤维二糖、葡萄糖等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用，而较高浓度时便开始抑制。当然，对于不一样微生物来说，同一浓度、同一物质也可能有着不一样甚至完全相反作用。纤维素酶专题知识专家讲座第13页纤维素酶作用原理纤维素酶降解纤维素部位优先发生在无定形区理论已得到普遍认可。这种理论认为，首先内切型纤维素酶作用于纤维素分子内部无定形区，随即水解β-1，4-糖苷键，将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端小分予纤维素，随即外切型纤维素酶，又称纤维二糖水解酶，作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。最终，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶专题知识专家讲座第14页纤维素酶专题知识专家讲座第15页纤维素酶发酵工艺纤维素酶分布非常广泛，主要有三个起源：1微生物起源：主要有霉菌、担子菌等真菌，也包含细菌、放线菌和一些原生动物。真菌中活力较高是木霉、黑曲、青霉和根霉等，细菌中有纤维杆菌、球形生孢纤维粘菌等，当前研究较多是绿色木霉和纤维杆菌；2是动物性起源：利用反刍动物瘤胃液制备纤维素酶粗酶制剂；3生物工程起源：迄今，人们已从40各种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶基因，并构建了这些酶基因文库。同时，利用基因工程伎俩对纤维素酶分子进行改造，使其活性提升，耐受性增强。纤维素酶专题知识专家讲座第16页培养基选择培养基以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)取代查氏培养基中蔗糖，其余配方不变；种子培养基为0.75％CMC-Na,0.5％蛋白胨，2％吐温80，0.03％MgSO4

、CaCl2

，H2O，微量FeSO4,MnSO4,ZnSO4,CoCI2

，自然pH；发酵培养基为0.75％CMC-Na，(NH4)2SO4

，2％吐温80，其余同种子培养基．纤维素酶专题知识专家讲座第17页方法1.刚果红染色法菌落长成后，往选择平板中加入适量1×10-3g／mL刚果红溶液，染色lh；弃去染液，加入适量lmol/LNaCI溶液，洗涤1h．菌体若能分泌纤维素酶，则在菌落周围会出现清楚透明水解圈，依据透明圈与菌落直径比值大小选择产酶菌株．2.还原糖测定采取3，5—二硝基水杨酸法(DNS法)．纤维素酶专题知识专家讲座第18页方法3.滤纸酶(FPase)活性测定：试管底部预先放置适当大小滤纸(约50mg)，加入1mL样品与1.5mL柠檬酸一Na2HPO4缓冲液(0.2mol／L，pH5.0)，50℃保温1h，扣除本底,测定反应后还原糖含量．酶活定义为上述条件下，每小时催化生成lμg葡萄糖酶量为一个U．纤维素酶专题知识专家讲座第19页菌种选育采集到土壤样本经无菌水洗涤后，吸收上清液梯度稀释，选取适当浓度涂布选择培养基，挑选出几株菌，纯化保藏．用刚果红染色法在选择培养基中复筛，挑选出4株有较强纤维素水解能力菌株，液体培养基中发酵，测其纤维素酶活性，选择其中酶活性最高一株保藏备用。纤维素酶专题知识专家讲座第20页发酵过程纤维素酶专题知识专家讲座第21页纤维素酶发酵工艺一:固体发酵工艺1固体发酵工艺特点:

固体发酵法又称麸曲培养法，是以秸秆粉、废纸、玉米秸秆粉为主要原料，拌入种曲后．装入盘或帘子上，摊成薄层(厚约1cm)，在培养室一定温度和湿度(RH90％一100％)下进行发酵。其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在有足够湿度固态底物上进行反应，发酵环境靠近于自然状态下微生物生长习性，产生酶系更全，有利于降解天然纤维素，且投资低、能耗低、产量高、操作简易、回收率高、无泡沫、需控参数少、环境污染小等。但固体发酵法易被杂菌污染，生产纤维素酶分离纯化较难．且色素不易去除。纤维素酶专题知识专家讲座第22页纤维素酶发酵工艺2固体发酵设备浅盘发酵器是比较惯用一个固态发酵设备，培养基经灭菌冷却后装入浅盘，经过空气增湿器调整空间温湿度进行发酵，工业化程度较低。固体发酵设备发展趋向是机械化发酵罐，尤其是流化床式固体发酵设备，发酵效果将更加好。3固体发酵工艺流程纤维素酶专题知识专家讲座第23页4固体发酵工艺条件固体发酵过程中温度、湿度、时间、水分、pH值等原因及其交互作用对发酵有显著影响，对周态发酵而言，温度是首要原因。培养基及培养条件优化，是降低酶制剂成本、提升酶活、实现其工业化生产主要办法。普通认为利用真菌进行固态发酵最好将培养基起始pH值调为酸性，这么有利于真菌生长而抑制细菌滋生。固态发酵培养基初始含水量，应视纤维素材料种类不一样而异。纤维素酶专题知识专家讲座第24页纤维素酶发酵工艺玉米秸秆培养基适宜含水量为1:(2—2.5)(w／w)，麦秸培养基适宜含水量为1:(1—1.5)，啤酒糟培养基含水量为1:1。靖德兵等采取均匀设计U15(58)和双温度培养法(前30h恒温30℃，后续恒温27℃)进行康氏木霉产酶固体发酵生产纤维素酶条件研究，结果表明，应用双温度培养法进行康氏木霉固体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基pH值自然(约6.5)并保持环境湿度约60％条件下，72h是适宜发酵周期。徐福建等提出了纤维素酶气相双动态固态发酵方式：在优化条件下(最正确压力脉冲范围、脉冲频率及气体内循环速率)，发酵温度得到很好地控制，910cm高填料层中最大温度梯度为0.12s℃／cm；以汽爆秸秆为底物，发酵水活度得到很好保持；动态培养发酵周期(60h)比静态发酵周期(84h)缩短了1／3，酶活(20136IU／g)比静态酶活(10182IU／g)提升了1倍，压力脉动固态培养料层上中下微生物生长情况均匀一致且疏松，而静态固态发酵料层中部几乎没有菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。纤维素酶专题知识专家讲座第25页纤维素酶发酵工艺二纤维素酶液态深层发酵工艺1液态深层发酵工艺特点液态深层发酵又称全方面发酵，是将秸秆等原料粉碎、预处理并灭菌后送至含有搅拌桨叶和通气系统密闭发酵罐内，接入菌种，借强大无菌空气或自吸气流进行充分搅拌，使气、液面积尽可能加大而进行发酵。其主要特点是培养条件轻易控制，不易染杂菌，生产效率高。液态深层发酵是当代生物技术之一，已成为国内外主要研究和开发工艺。纤维素酶专题知识专家讲座第26页纤维素酶发酵工艺2液态深层发酵设备液态深层发酵普通采取含有搅拌桨叶和通气系统菌体生长。利用气相双动态固态发酵可为纤维素酶大规模生产奠定基础。3液态深层发酵工艺流程纤维素酶专题知识专家讲座第27页纤维素酶发酵工艺4液体深层发酵工艺条件液体发酵时问约为70h，温度普通低于60℃。液态发酵中使用接种量显著低于固态发酵，其接种量浓度普通为2％一10％(v／v)。张冬艳等研究了绿色木霉AS.3.3711、康宁木霉AS.3.2774、木霉AS.3.3032和康宁木霉ACC.3.167适宜发酵产酶条件，结果表明,最适温度为28℃，产酶适宜起始pH值为4.5—5.5。曾青兰等对丝状真菌菌株GibbereUaf可ikuroi产纤维素酶条件进行了研究，结果表明，接种量为5％、培养时间为120h、培养温度为28～37℃、培养基初始pH值为5—6时，产酶能够达最正确值。纤维素酶专题知识专家讲座第28页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化1.1菌种绿色木霉(TrichodermavirldeAS3．3032)原菌种移接在麦芽汁琼脂斜面培养基上。1.2产酶培养基原料麦麸、汽爆蔗渣、稻草粉，过60目筛备用。1.3固态发酵产酶培养基麦麸：汽爆蔗渣(3：2)，(NH4)SO4,1％，加自来水2.5倍量。纤维素酶专题知识专家讲座第29页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.1氯源影响基础固体培养基中其余成份不变，加入不一样氮源，28qc培养4d，测定酶活力结果表明：绿色木霉在以硫酸铵为氮源培养基上生长最旺盛，其FPA，CMC和β-Case酶活力均较高，所以在以后试验中以硫酸铵为氮源。纤维素酶专题知识专家讲座第30页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.2碳源影响2.2.I麦麸和蔗渣比倒对产酶影响基础固体培育基中其余成份不变，加入不一样百分比麦麸和蔗渣，28℃培养4d，测定酶活力结果表明：在一定范围内，麦麸百分比越大，菌体生长旺盛，产孢子多，酶活力也逐步增加；而蔗渣含量在一定范围内也有刺激酶活力上升作用．二者相互作用，在麸蔗比为3：2时，FPA，0-Gase和CMC酶活力均为最高，这种“诱导”作用，可能是麦麸中淀粉和微量生长因子以及蔗渣中纤维素刺激所致。纤维素酶专题知识专家讲座第31页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.2.2碳源对产酶影响分别添加1％不一样碳源，进行产酶试验。结果大多数代谢中间产物如纤维二糖、木糖、葡萄糖作碳源时，酶活力低，而麦麸作碳源时，纤维素酶较高。纤维素酶专题知识专家讲座第32页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.3表面活性剂对产酶影响添加不一样浓度TweenI80和洗衣粉，进行产酶试验比较。结果表明Tween一80和熊猫牌洗衣粉均能促进绿色木霉产纤维索素，添加01％TweenI80和05％～0．7％熊猫牌洗衣粉可分别提升FPA，8一Gase和CMC为2.3倍、2.8倍、2.3倍和3.1倍、3.7倍、3.0倍．这主要是因为表面活性剂一定浓度时能够改变真菌质膜透性，使酶更多地从胞内释放而提升酶产量．然而表面活性剂浓度过大时，膜能够解体，透性大增，使细胞内电解质大量外渗，加上细胞内各细胞器膜被破坏，各种代谢失调甚至死亡，产酶活力自然受到抑制。纤维素酶专题知识专家讲座第33页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2．4接种方式对产酶影响种子悬浮液接种固态发酵比直接用孢子接种发酵产酶周期短，但种子悬浮液量不宜过大，若太大将影响产酶培养基透气性，使产酶活力下降．种子悬浮液接种发酵产酶周期短原因可能是因为种子悬浮液内含有一定量糖苷酶活，且接种总量大于孢子，分部也比较均匀，这种方式为液固式发酵。．纤维素酶专题知识专家讲座第34页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.5培养基含水量对产酶影响固体培养基水分对于绿色木霉菌种有两方面作用，一是水分是木霉菌新陈代谢所必须物质，二是含水量高低与通气性有着亲密关系。在满足木霉菌所需氧情况下，产酶活力伴随培养基含水量增加而增栅．若含水量超出250％时，通气量不能满足木霉菌生长需要而使产酶活力下降。纤维素酶专题知识专家讲座第35页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.6培养温度对产酶影响结果，在较高温和较低温时，绿色木霉产酶活力都较低，28℃是产酶最正确温度，在较高温状态下，菌体生长较快，但不利于产酶，较低温虽菌体生长较慢，但可延长产酶时间。纤维素酶专题知识专家讲座第36页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化2.7起始pH值对产酶影响结果，初始pH值对绿色木霉产酶活力影响很大，起始pH3.5时产酶活力最大，这么低pH值可预防杂菌污染，通常培养基以略为偏酸为宜．但也不能酸度过大，若pH值低于3.5，菌种生长困难，纤维素酶活力很低。纤维素酶专题知识专家讲座第37页绿色木霉纤维素酶AS3．3032固态发酵条件优化结论(1)碳源和氮源对绿色木霉产纤维素酶有显著影响，氮源以硫酸铵为佳，且复合碳源中麦麸：甘蔗渣=3：2时产酶活力最高，使β一Gase酶活靠近FPA水平。(2)液体种子接种比直接用孢子接种发酵周期短，但液体种子接种量不宜太大。(3)表面活性剂对产酶活力影响较大，添加0.1％Tween-80和0.5％～0.7％熊猫牌洗衣粉都可显著提升绿色木菌产酶活力。(4)培养基含水量、培养温度和起始pH值对产酶活力都有显著影响。纤维素酶专题知识专家讲座第38页展望

1、深入加强纤维素酶作用机制研究。纤维素酶应用于饲料，作用于动物消化道，其机制还未清楚。从理论上决定其添加量还很困难，当前只能从试验结果来决定，受影响原因很多，往往效果不够理想。对于单用各种原料纤维素酶最正确添加量也研究不多，这将严重制约纤维素酶推广应用。

2、当前纤维素酶产量和活性都不高，成本偏高，今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，以提升其产量和活性，尤其是要注意利用DNA基因重