目基因分离专业知识讲座

原核生物基因组成

目基因分离专业知识讲座第1页真核生物基因组成

目基因分离专业知识讲座第2页真核生物基因组成

目基因分离专业知识讲座第3页结构基因

结构基因（Structuralgene）是指一类不但可转录成信使RNA（mRNA），而且可翻译成多肽链，从而组成各种结构蛋白质（包含催化各种生化反应酶）基因。目基因分离专业知识讲座第4页第一节目标基因制备

直接分离法构建基因组文库分离法构建cDNA基因文库分离法聚合酶链式反应技术扩增目标基因基因化学合成

目基因分离专业知识讲座第5页一、直接分离法限制性核酸内切酶酶切分离法基因分离物理化学法“鸟枪法”目基因分离专业知识讲座第6页目基因分离专业知识讲座第7页二、构建基因组文库分离法1、基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小片段，然后将这些片段与适当载体连接，转入受体细菌或细胞，这么每一个细胞接收了含有一个基因组DNA片段与载体连接重组DNA分子，而且能够繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆集合体。目基因分离专业知识讲座第8页2、基本步骤①细胞染色体大分子DNA提取和大片段制备；②载体DNA制备；③载体与外源大片段连接；④体外包装及基因组DNA文库扩增；⑤重组DNA筛选和判定。

目基因分离专业知识讲座第9页3、基因组DNA文库特点1975年，Clarke和Carbon提出计算重组子数目标公式：N=ln（1-P）/ln（1-f）目基因分离专业知识讲座第10页三、构建cDNA基因文库分离法

1、cDNA基因文库概念提取出组织细胞全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当载体惯用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这么包含着细胞全部mRNA信息cDNA克隆集合称为该组织细胞cDNA文库。目基因分离专业知识讲座第11页2、构建步骤

细胞总RNA制备及mRNA分离与完整性确实定；cDNA第一条链与双链cDNA合成及克隆；cDNA与载体连接、噬菌体颗粒包装及转染或质粒转化与判定等。目基因分离专业知识讲座第12页3、cDNA克隆主要优点尤其适合用于一些RNA病毒基因组结构研究筛选比较简单易行

目标基因选择中出现假阳性概率比较低可用于在细菌中能进行表示基因克隆可用于真核细胞mRNA结构和功效研究目基因分离专业知识讲座第13页4、cDNA克隆主要缺点cDNA文库所包含遗传信息要远远少于基因组DNA文库不能直接取得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列结构与功效方面信息低丰度mRNA

cDDNA克隆所占百分比比较低目基因分离专业知识讲座第14页四、聚合酶链式反应技术扩增目标基因聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）技术简称PCR技术，是一个体外扩增特异DNA片段技术。目基因分离专业知识讲座第15页第四节目标基因

二、分离目标基因路径4、聚合酶链式反应技术扩增目标基因PCR原理

：经过温度改变控制DNA变性和复性，并设计引物做开启子，加入DNA聚合酶、dNTP就能够完成特定基因体外复制。1、PCR原理

目基因分离专业知识讲座第16页2、PCR步骤DNA变性（90℃-96℃）退火（25℃-65℃）延伸（70℃-75℃）

目基因分离专业知识讲座第17页3、经典PCR反应体系

目基因分离专业知识讲座第18页五、基因化学合成

人工合成基因方法主要有两条路径：生物合成化学合成目基因分离专业知识讲座第19页1、全片段酶促连接法目基因分离专业知识讲座第20页2、酶促填充法目基因分离专业知识讲座第21页第二节核酸制备

天然DNA制备天然RNA制备核酸样品分析与检测目基因分离专业知识讲座第22页染色体DNA病毒和噬菌体DNA

质粒DNA线粒体