免疫印迹法的实验技术

免疫印迹法试验技术

（WesternBlot印迹方法）免疫印迹法的实验技术第1页

一、Western-Blot介绍WesternBlot，又称为免疫印迹（Immunoblot）,是70年代末80年代初发展起来蛋白质测定技术。蛋白质印迹创造者普通认为是美国斯坦福大学乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。免疫印迹法的实验技术第2页印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用对应探测反应来检测样品一个方法。WesternBlot印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目标蛋白定性方法，也可作为确定同一个蛋白质在不一样细胞或者同一个细胞不一样条件下相对含量半定量方法。免疫印迹法的实验技术第3页试验主要内容：试验用途2试验注意事项

4试验方法及步骤33

试验原理31免疫印迹法的实验技术第4页试验原理

将取得蛋白质样品经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS)】电泳使蛋白质按分子量大小进行分离

→凝胶上分离到蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF膜）上→用抗靶蛋白非标识抗体（一抗）与转印后膜上靶蛋白进行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标识（偶联）二抗结合→用ECL发光或DAB显色检测。假如转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。免疫印迹法的实验技术第5页WesternBlot采取是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识二抗。经过PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（比如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应抗体起免疫反应，再与酶或同位素标识第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目标基因表示蛋白成份。该技术也广泛应用于检测蛋白水平表示。免疫印迹法的实验技术第6页试验用途用于检测样品中特异性蛋白质是否存在。对特异性蛋白质进行半定量分析。免疫印迹法的实验技术第7页蛋白免疫印迹组成凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带2把凝胶中已分成条带蛋白质转移到一个固相支持物上样品印迹3用特异性抗体检测出已经印迹在膜上所要研究对应抗原免疫学检测免疫印迹法的实验技术第8页试验步骤

提取细胞或组织蛋白→测定蛋白含量→制备SDS胶→蛋白变性、上样→电泳→转膜→封闭→一抗→TBST洗膜→HRP标识二抗→TBST洗膜→ECL底物显色→X光片曝光、显色→结果分析免疫印迹法的实验技术第9页免疫印迹法的实验技术第10页

二、蛋白样本制备和浓度测定蛋白提取：普通包含组织蛋白提取、细胞蛋白提取组织蛋白提取组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为预防细胞内蛋白酶对蛋白质降解）按百分比配制-置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4℃离心，1rpm，10min取上清分装1.5ml离心管中－20℃保留。（低温和蛋白酶抑制剂能够降低蛋白降解。）

蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要依据详细情况详细选择。免疫印迹法的实验技术第11页注意事项

注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，马上用大量水冲洗。所用离心机需提前预冷。为预防蛋白降解，全部操作应在冰上完成。吸收蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。免疫印迹法的实验技术第12页蛋白浓度测定原因：WesternBlot作为一项半定量试验技术，电泳前，必须对不一样样品进行总蛋白含量测定。蛋白质总量不足可能妨碍对目标蛋白判定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法分辨力。免疫印迹法的实验技术第13页方法：当前惯用有五种经典方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford法）。当前试验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试剂盒.免疫印迹法的实验技术第14页BCA法工作原理BCA(bicinchoninicacid二辛可酸)法测定蛋白质原理与Lowery法相同。即在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定紫蓝色复合物，在562nM处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色深浅与蛋白质含量成正比，能够依据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成颜色复合物稳定性俱佳，而且受干扰物质去垢剂等影响小。免疫印迹法的实验技术第15页SDS电泳SDS电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法。原理1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一个阴离子表面活性剂，能使蛋白质氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一定条件下，大多数蛋白质与SDS结合（1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度负电荷，其数量远远超出了蛋白质分子原有电荷量，从而掩盖了不一样种类蛋白质间原有电荷差异。此时，蛋白质分子电泳迁移率主要取决于它分子量大小，而其它原因对电泳迁移率影响几乎能够忽略不计。免疫印迹法的实验技术第16页免疫印迹法的实验技术第17页试验前准备设备和材料准备:电泳槽准备(本试验用垂直电泳槽)、电泳仪准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、烧杯、量筒试剂准备和配置:双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为8.8)、Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、蛋白Marker免疫印迹法的实验技术第18页依据待测样品蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶浓度.（普通浓缩胶为5%，分离胶依据所测蛋白分子量定）凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212免疫印迹法的实验技术第19页作用浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷多肽复合物向正极推进。样品首先经过高度多孔性浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄区带（或称积层）（0.5-1cm）。分离胶：因为胶孔径小，而且成为一个整体筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率差异，最终到达彼此分开。(PH为8.8)免疫印迹法的实验技术第20页试验步骤

组装SDS凝胶用玻璃槽↓配制和灌注分离胶↓用水压线30-40分钟直至分离胶凝固↓

倒掉压线水配制和灌注浓缩胶↓插入样品梳↓

凝胶直至浓缩胶凝固↓制备样品样品:上样缓冲液=4:1,混匀1000C加热5分钟,离心取上清)

↓

拔出样品梳↓加入电泳缓冲液,上样，电泳↓电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停顿夹心式垂直电泳槽免疫印迹法的实验技术第21页蛋白变性原因上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液混合物，按百分比配制，100℃煮5min。其目标是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。免疫印迹法的实验技术第22页注意事项玻璃板要清洁,对齐卡严，预防漏胶。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前含有很强神经毒性并轻易吸附于皮肤，其作用含有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩.过硫酸铵会迟缓分解，应隔周新鲜配制.溶液中一旦加入TEMED，应马上混匀并快速灌注入玻璃夹槽中.浓缩胶缓冲液(PH为6.8)、分离胶缓冲液(PH8.8)，PH值要准确。胶灌入前要充分混匀，灌胶要迟缓,防止有气泡产生.为保持电泳平衡，在无样品孔中也应加入适量电泳上样缓冲液.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以确保蛋白由上向下方向电泳。免疫印迹法的实验技术第23页说明：不是全部蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发觉有些蛋白质用这种方法测出分子量是不可靠。包含：电荷异常或构象异常蛋白质，带有较大辅基蛋白质（如一些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。比如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，所以，尽管结合了正常百分比SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷影响，它分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定结果却是35,000。所以，最好最少用两种方法来测定未知样品分子量，相互验证。有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链。所以，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定只是它们亚基或单条肽链分子量，而不是完整分子分子量。为了得到更全方面资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链数目等，与SDS-凝胶电泳结果相互参考。免疫印迹法的实验技术第24页四、转膜蛋白质印迹法就是将电泳后分离蛋白质从凝胶中转移到固相支持物上。惯用固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。PVDF（聚偏二氟乙烯），其含有更加好蛋白吸附、物理强度，以及含有更加好化学兼容性，价格比NC膜要贵。NC膜更惯用。免疫印迹法的实验技术第25页附：膜选择主要依据：膜与目标蛋白分子结合能力（也就是单位面积膜能结合蛋白载量）膜孔径（也就是拦截蛋白大小）有两种规格：0.45um和0.2um（forMW<20kDa)。不影响后续显色检测（也就是适适用于所选显色方法）免疫印迹法的实验技术第26页转膜通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。电泳印迹效率更高。这种方法是用有孔塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成"三明治"形状，而后浸入两个平行电极中间缓冲液中进行电泳，选择适当电泳方向就能够使蛋白质离开凝胶结合在膜上。转移后膜就称为一个印（blot），用于对蛋白质深入检测。免疫印迹法的实验技术第27页试验前准备

设备和材料准备:转移电泳槽准备(本试验用垂直电泳槽)、转移电泳仪准备、膜、滤纸、海绵垫、玻璃棒试剂准备和配置:电转液、甲醇（PVDF膜）、（考马斯亮蓝染色液、丽春红染色液）免疫印迹法的实验技术第28页依据待测样品蛋白质分子量选择转移电流大小及时间.我们通常200mA/膜，按照目标蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，详细能够依据实际适当调整。目标蛋白分子大小(kDa)胶浓度

转移时间(h)

801408%

1.5-2.0

258010%

1.5

15—4012%

0.75

<2015%0.5免疫印迹法的实验技术第29页试验步骤NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须确保NC膜一直完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，防止手上蛋白将膜污染。）剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时4层海绵垫也用转移液浸泡。取胶：撬开玻璃板，将多出胶切除，把裁好胶放人转移液中。转膜①制作“三明治”：由夹子黑板（阴极）侧开始，依次为黑板→海绵垫片→3层滤纸→胶→NC膜→三层滤纸（注意：排除气泡）→海绵垫片(阳极)，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。

免疫印迹法的实验技术第30页免疫印迹法的实验技术第31页②正确连接转移电泳连线，确保电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在4℃进行）。③小心取出转移膜，做好标识，在1×TBST液中漂洗两次。（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检验蛋白转移是否完全,用丽春红染色液膜,检测蛋白质是否转移到膜上.）免疫印迹法的实验技术第32页打开转膜夹板，由阴极侧海绵垫片→3层滤纸→样品凝胶→NC膜→三层滤纸（排除气泡）→海绵垫片阳极侧免疫印迹法的实验技术第33页试验注意事项

PVDF膜需100%甲醇预处理，再用缓冲液平衡，才能用。必须确保NC膜一直完全浸于转移缓冲液中,滤纸要充分浸于转移缓冲液中.操作要轻，防止胶膜破损。记住“黑面胶，白面膜”，夹子黑面朝架子黑面。必须确保“三明治”各层之间均无气泡。电转移时最好为恒流,电转移时间和电流大小取决于凝胶厚度和蛋白质分子量大小.分子量大,电流稍大时间长;分子量大,电流小时间短;注意做好膜上标识。免疫印迹法的实验技术第34页五、固相免疫检测转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目标蛋白。免疫印迹法的实验技术第35页DAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从而指示目标蛋白位置及强弱。ECL试剂采取氧化还原反应原理：利用二抗上标识辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化还原反应，从而发出荧光。ECL发光相对于DAB显色而言，含有发光持久，灵敏度高(普通可到达pg级以上)等优点，且DAB含有致癌性。免疫印迹法的实验技术第36页ECL结果DAB结果免疫印迹法的实验技术第37页试验前准备

1.设备和材料准备:洗膜用平皿摇床ECL发光所需(避光盒、X-光片、X-光片曝光盒等)2.试剂准备和配置:封闭液(5%脱脂奶粉、BSA、WesternBlot膜封闭液）

一抗二抗抗体稀释液TBST缓冲液ECL试剂盒或DAB试剂盒免疫印迹法的实验技术第38页试验步骤

1、封闭：将转移后膜浸入封闭液中，室温、摇床上迟缓摇动封闭1h（或4℃过夜）；（封闭硝酸纤维素膜上剩下疏水结合位点，使抗体只能跟特异蛋白结合）2.一抗反应

①将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；

②将封闭后膜放入一抗工作液中，4℃反应过夜(或37℃,2小时)。3.洗膜

将膜从一抗中取出，TBST洗涤10min×3，室温下迟缓摇动洗涤。4.二抗反应

①将二抗用抗体稀释液稀释到所需浓度。

②将膜放入二抗工作液中室温30min。5.洗膜TBST洗涤10min×3，室温下迟缓摇动洗涤6.曝光及洗片（或DAB显色）免疫印迹法的实验技术第39页曝光及洗片方法①按1:1（v/v）混合ECL试剂盒中两种液体。②将上述混合液均匀铺在NC膜表面，室温作用2分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC膜（防止在膜上面出现气泡）。③在暗室中（红光下）将X光胶片直接压于包裹后膜上，曝光盒中曝光适当初间。④将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影1分钟（详细曝光时间及显影时间需依据显影结果作出调整）免疫印迹法的实验技术第40页试验注意事项

1.处理膜过程中，切勿使膜干掉（不然造成背景增高）2.选择适当一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会造成背景变黑）3.应考虑ＥＣＬ试剂发光强度及其淬灭时间来选择适当曝光时间。4.保鲜膜包裹NC膜时，防止膜上有气泡，影响显影。5、显影、定影要充分，X平要完全浸没在液面下。免疫印迹法的实验技术第41页WesternBlot常见问题分析

SDS电泳

胶不平？