蛋白质分离、纯化

蛋白质分离、纯化第1页/共52页第七章

蛋白质的分离、纯化第2页/共52页蛋白质分离、纯化主要依据

（1）蛋白质的分子大小透析、超滤、分子筛层析（2）蛋白质的带电特性等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳（3）蛋白质的溶解特性硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离第3页/共52页

（一）材料

1、选材

2、破碎

3、混合物的分离（二）粗分级（三）细分级

第4页/共52页采用简单的实验技术手段，比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。蛋白质粗分级第5页/共52页一、盐析盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。常用硫酸铵进行沉淀。分级沉淀：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋白质分阶段沉淀下来。优点：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。不足：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程产生不良影响。第6页/共52页二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温。第7页/共52页三、超速离心法

在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开。第8页/共52页四、等电点沉淀法

在一定的pH条件下，蛋白质所带的净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。Protein的等电点（PI）

1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectricpoint).2、当pH值>PI时，蛋白质带负电荷当pH值<PI时，蛋白质带正电荷当pH值=PI时，蛋白质带净电荷为零电泳分离正极移动负极移动不移动第9页/共52页五透析按照分子大小进行分离.分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品

透析袋

开始透析处于平衡状态一般用于除盐类和小分子杂质第10页/共52页五、透析第11页/共52页六、超滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液第12页/共52页采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等手段结合多种电泳技术，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等进一步对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究。

蛋白质细分级第13页/共52页一、凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。第14页/共52页凝胶层析原理：

1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；

2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。第15页/共52页具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）

型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15

分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）

孔径大，用于分离大分子物质

聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）第16页/共52页带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图第17页/共52页

凝胶的前处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。第18页/共52页1.将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。2.将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。3.用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。

装柱第19页/共52页样品上柱、洗脱、收集

1.如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面2.沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。3.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。4.用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。第20页/共52页凝胶的再生及保存再生

用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法

0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷第21页/共52页二、离子交换层析蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。当pI<pH时，蛋白质带净负电荷；而当pI>pH时，蛋白质带净正电荷。注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。第22页/共52页离子交换层析可分为阳离子交换与阴离子交换。

1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；

2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。第23页/共52页阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质低离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集第24页/共52页离子交换层析第25页/共52页三、亲和层析

原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。

配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体.

第26页/共52页含配体溶液收集目的蛋白

洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）第27页/共52页电泳法类型：1、区带电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。

2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。第28页/共52页1．原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

第29页/共52页聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；灵敏度高，可达10-6g；分辨率高。第30页/共52页分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 分子量范围与凝胶浓度的关系凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关

第31页/共52页垂直板电泳第32页/共52页垂直板电泳第33页/共52页垂直板电泳第34页/共52页蛋白质微型电泳系统第35页/共52页SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。

2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。第36页/共52页SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳第37页/共52页实验方法：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

聚丙烯酰胺凝胶的制备

蛋白质样品准备

点样

电泳染色与脱色样品回收第38页/共52页等电聚焦（Isoelectricfocusing）(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)载体两性电解质：

a是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。

b混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；

c混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；

d要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。第39页/共52页等电聚焦（Isoelectricfocusing）

通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。注意事项：1、时间相对长对分离有利；

2、也可用来测定蛋白质的等电点。第40页/共52页第41页/共52页等电聚焦（Isoelectricfocusing）第42页/共52页蛋白质含量测定与蛋白质鉴定

在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。

蛋白质含量测定有很多方法凯氏定氮法双缩脲法福林-酚法考马斯亮蓝比色法紫外吸收法蛋白质鉴定包括很多内容，蛋白质分子量与等电点的测定蛋白质氨基酸组成及顺序的分析蛋白质结晶与结构分析蛋白质生物活性及功能测定第43页/共52页蛋白质含量测定

最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为16%，假设测得样品中的含氮量为1g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25g。

紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在280nm和260nm的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（mg／mL）＝1.45×A280nm－0.74×A260nm，很容易计算出样品的蛋白质含量。

分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量。第44页/共52页蛋白质鉴定

蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：蛋白质纯度鉴定蛋白质分子量及等电点测定蛋白质氨基酸组成及顺序分析蛋白质结晶与结构分析蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定蛋白质生物活性及功能测定

第45页/共52页（一）蛋白质纯度鉴定：

目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法，电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。（二）蛋白质分子量及等电点测定：蛋白质分子量测定有多种方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最常用的方法之一。采用IEF可测定蛋白质等电点。

第46页/共52页（三）蛋白质氨基酸组成及顺序分析

1．蛋白质氨基酸组成分析

首先将蛋白质水解为氨基酸，通常情况下采用酸水解，蛋白质水解后的氨基酸混合物可通过全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定。2．蛋白质氨基酸顺序分析

主要是对纯化的蛋白质进行氨基酸组成分析，然后采用末端分析法测定其N-端和C-端氨基酸，采用蛋白酶或化学法裂解成若干有重叠的肽段后采用Edman降解法测定每一肽段的氨基酸顺序，再利用重叠肽组建整个多肽的氨基酸序列。最后确定二硫键的位置。

第47页/共52页（四）蛋白质结晶与结构分析

蛋白质在一定条件下会形成结构均一的晶体，蛋白质结晶不仅是蛋白质纯度鉴定的一个指标，也是蛋白质活性鉴定的一个指标。蛋白质三维结构分析的主要方法有X-射线晶体衍射法和核磁共