抗生素产生菌的菌种筛选及优化

抗生素产生菌的菌种筛选及优化抗生素产生菌的菌种筛选及优化第1页1、抗生素产生菌教材第一章、第一节：p1-19半数以上抗生素由放线菌产生，链霉菌，真菌与细菌。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第2页真菌抗生素真菌抗生素主要是青霉和产黄青霉产生青霉素，灰黄青霉产生灰黄霉素。灰黄霉素抗真菌（皮肤病与灰指甲病），对细菌无效。青霉素抗G+菌有效，对G-菌作用很弱，对人副作用小，有过敏反应。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第3页青霉素是一类群化合物，不一样青霉素侧链R各异。常见青霉素G，R为苯甲基。低浓度抑菌，高浓度杀菌。有细菌产生青霉素酶，使酰胺环开裂而失去作用。细菌抗生素多是多肽类化合物。如短杆菌短杆菌素S，枯草芽孢杆菌枯草杆菌肽，多粘芽孢杆菌多粘菌素等，对动物有毒性，只限外用。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第4页抗生素产生菌分离和筛选当前新抗生素取得路径：

1、从自然界分离筛选新抗生素产生菌从土壤到海洋；到极端微生物；从微生物到植物、动物。2、改造现有已知抗生素产生菌，再经筛选取得新得抗生素产生菌。3、从已知抗生素进行结构改造，经筛选取得新半合成抗生素。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第5页

4、采取新筛选方法

如：应用定向生物合成和突变生物合成原理，以及培养超敏细菌以寻找微量抗生素，选取新肿瘤模型来筛选抗肿瘤抗生素。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第6页5、采取当代分子生物学技术产生新抗生素（1）基因克隆产生新抗生素：首先取得某已知抗生素结构基因，然后经过一定载体将基因片段导入特定另一个抗生素产生菌中，则可能产生完全符合大家设计要求新抗生素。（2）缄默基因激活：引入抗生素生物合成调控基因，有可能激发抗生素产生菌处于休眠状态或缄默状态基因系统，从而开启另一结构抗生素生物合成开关，得到新抗生素。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第7页生产中常见菌种分离、选育和保藏

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第8页一、菌种起源依据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购置；从大自然中分离筛选新微生物菌种。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第9页二、分离思绪

新菌种分离是要从混杂各类微生物中依照生产要求、菌种特征，采取各种筛选方法，快速、准确地把所需要菌种挑选出来。试验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良菌种，还要有适当工艺条件和合理先进设备与之配合。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第10页定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种生长培养特征。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地经过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特征包含形态、培养特征、营养要求、生理生化特征、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选步骤抗生素产生菌的菌种筛选及优化第11页

（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。普通园田土和耕作过沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样对象也能够是植物，腐败物品，一些水域等。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第12页从自然界筛选抗生素产生菌的菌种筛选及优化第13页2、采样季节：以温度适中，雨量不多秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处土约10g，盛入清洁牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标识，统计采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物数量和类型尽少改变，宜将样品逐步分批寄回，方便及时分离。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第14页培养基组成标准大多数放线菌分离培养是在贫脊或复杂底物琼脂平板上进行。除嗜温性放线菌外，其它放线菌普通在培养4-20天内在分离平板上迟缓形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，普通皆应在37℃培养箱中存放3天。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第15页培养基选择和配制标准营养吸收过程微生物营养活动是依靠外界分泌大量酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现。培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要,按一定百分比配制各种营养物质混合物。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第16页培养基选择和配制标准培养基设计所要考虑问题为微生物生长繁殖、产物合成提供所需物质。工业发酵考虑原料价格问题。培养基设计共同特点碳源、氮源、无机元素、生长因子、水、氧气抗生素产生菌的菌种筛选及优化第17页一、培养基类型和用途据起源天然培养基、合成培养基、半合成培养基液体培养基、固体培养基、半固体培养基主要成份或使用目标基础培养基、增殖培养基、判别培养基、选择培养基据生产工艺孢子培养基、种子培养基、发酵培养基抗生素产生菌的菌种筛选及优化第18页二、培养基选择据微生物特点来选择细菌、酵母菌、霉菌、放线菌据发酵方式选择培养基液体培养基、固体培养基从生产实践和科学试验种子培养基、发酵培养基从经济效益方面考虑选择生产原料价廉、起源丰富、运输方便抗生素产生菌的菌种筛选及优化第19页三、培养基配制标准据不一样微生物营养需要配制不一样培养基营养成份恰当配比C/N渗透压PH抗生素产生菌的菌种筛选及优化第20页四、培养基成份配比选择参考前人所使用某一类菌种培养基经验配方结合菌种和产品特征确定初始配方对碳源、氮、无机盐、前体等种类和量进行逐一单因子试验观察对菌体生长、产物合成影响综合考虑各种原因，得到适合菌种配方对其结果加以验证最终确认最正确配方抗生素产生菌的菌种筛选及优化第21页四、培养基成份配比选择对代谢路径清楚主要代谢产物，能够依据物料平衡加以确定如：青霉素发酵抗生素产生菌的菌种筛选及优化第22页微生物所需要物质碳源、氮源、无机元素、生长因子、水、氧气在发酵工业中、必须使用廉价原料来配制培养基，而且尽可能满足以下要求消耗每克底物将产生最大菌体得率或产物得率能产生最高产品或菌体浓度能得到产物最大速率副产品得率最小价廉而且有稳定质量起源丰富且供给充分通气和搅拌、提纯、废物处理等生产工艺较轻易另外培养基选择还会影响发酵罐设计抗生素产生菌的菌种筛选及优化第23页（1）糖（2）脂肪（3）醇、有机酸（4）碳氢化合物

除此之外，酒精、有机酸、烷烃等含碳物质越来越引发大家重视。

供给菌体生命活动所需要能量和组成菌体细胞以及代谢产物基础碳源抗生素产生菌的菌种筛选及优化第24页（1）无机：氨水、铵盐、硝酸盐（2）有机：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉

氮源抗生素产生菌的菌种筛选及优化第25页

组成菌体成份、作为酶组成个别，酶激活剂、抑制剂、调整渗透压、调整ph，氧化还原电位磷酸盐、硫酸盐、氯化物、钾、钠、镁、铁、铜、锰、钼、碘、溴特点：需要量少，但作用重大无机盐抗生素产生菌的菌种筛选及优化第26页微生物生长不可缺乏微量有机物质：组成细胞组分、促进生命活动进行。（1）生物素（2）VB2（3）提供生长因子农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、酵母膏

生长因子抗生素产生菌的菌种筛选及优化第27页

与菌种特征和生物合成产物代谢控制相关，但并不促进菌体生长。（1）前体物质一些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其本身结构并没有多大改变，但产物量却因加入而有较大提升。如：氨基酸、核苷酸、抗生素（2）促进剂、抑制剂如：诱导物、表面活性剂前体物质和促进剂抗生素产生菌的菌种筛选及优化第28页

作用：促进生长发育推迟菌体自溶抑制了无用代谢路径改变发酵液物理性质、改进通气量促进产物合成抑制杂菌前体物质和促进剂抗生素产生菌的菌种筛选及优化第29页放线菌分离土样中放线菌非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌分离：无菌取植物组织，干燥以降低细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌分离：为使所要分离放线菌数量种类增多，普通将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第30页次代培养及纯化菌落形成后可依据肉眼可见菌落形态上差异，作初步判定和区分。经过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不一样放线菌属及种关键是所采集样本本身及其分离用琼脂培养基；而肉眼识别不一样生长形态、从而初步地加以判定，在分离放线菌时显得尤为主要。将分离平板上所形成菌落用经火焰灼烧灭菌钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以深入筛选和分离。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第31页带图象分析系统微生物菌种

显微观察装置

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第32页筛选：是指从大量待筛选微生物中，尽快地判别出有实用价值抗生素产生菌试验过程。

1、筛选模型：是指筛选工作中所使用试验菌。为了防止感染病原菌危险，尽可能选取非致病、且能代表一些类型致病菌微生物作为试验菌。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第33页常见试验菌和代表致病微生物

试验菌代表致病微生物

金黄色葡萄球菌革兰阳性球菌枯草芽孢杆菌革兰阳性杆菌耻垢分支杆菌结核分枝杆菌大肠埃希菌革兰阴性杆菌白假丝酵母菌酵母状真菌曲霉丝状真菌噬菌体病毒、肿瘤细胞抗生素产生菌的菌种筛选及优化第34页筛选方法

抗菌抗生素普通采取琼脂扩散法。

先制备含试验菌平板，然后以无菌滤纸片蘸取各放线菌摇瓶培养发酵液或切取一定大小放线菌琼脂培养块，置于含菌平板上，培养后观察有没有抑菌圈产生。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第35页微生物群体生长规律生长曲线代表在新适应环境中生长、分裂直至衰老、死亡全过程动态改变规律。分为迟缓期、对数期、稳定时和死亡期四个主要时期。生长曲线不一样时期反应是群体而不是单个细胞生长规律。认识和掌握微生物生长曲线有主要实践意义。如设法缩短迟缓期、延长对数期以及在稳定时搜集菌体。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第36页无分支单细胞微生物群体生长曲线抗生素产生菌的菌种筛选及优化第37页1.迟缓期（1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。（2）原因：在新环境，缺乏分解或催化相关底物酶。（3）缩短和消除迟缓期方法有：增加接种量、采取最适种龄、选取繁殖速度快菌种以及尽可能保持接种前后所处培养基介质和条件一致。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第38页2.对数期（1）特点：分裂速度最快、代时最短、代谢活动旺盛、对环境改变敏感。（2）作用：作为代谢、生理等研究好材料和发酵生产中用作种子最正确菌龄。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第39页3.稳定时（1）特点：新生细胞和死亡细胞数目相等、总菌数到达最大值、代谢活力钝化。（2）原因：营养物质逐步消耗以及代谢废物积累抑制了生长。（3）功效：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定时研究发展了连续培养技术。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第40页4.死亡期

特点：活细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第41页丝状微生物群体生长1.特征：丝状生长和沉淀生长两种方式。2.丝状微生物生长以单位时间内微生物物质量改变来表示。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第42页抗生素产生菌的菌种筛选及优化第43页三、连续培养（一）分批培养和连续培养1.概念：

分批培养：指将微生物置于一定容积培养基中，经过培养生长，最终一次收获培养方式。

连续培养：在一个恒定容积流动系统中培养微生物，首先以一定速率不停地加入新培养基，另首先又以相同速率流出培养物(菌体和代谢产物)，以使培养系统中细胞数量和营养状态保持稳定。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第44页2.连续培养系统类型

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第45页环境原因对微生物生长影响一、温度抗生素产生菌的菌种筛选及优化第46页

温度太低：使原生质膜处于凝固状态，不能正常进行营养物质运输或形成质子梯度。温度太高：蛋白质、核酸和细胞其它组成发生不可逆变形作用。

最低生长温度三种基础温度最适生长温度最高生长温度抗生素产生菌的菌种筛选及优化第47页依据生长温度分类：

1.嗜冷微生物2.嗜温微生物

3.嗜热微生物4.嗜高热微生物抗生素产生菌的菌种筛选及优化第48页1.嗜冷微生物能够在低温条件下生长原因是：其所含酶在低温能有效地催化生化反应；在低温下主动运输仍能正常进行，有效吸收必须营养物质，是其原生质膜中含有较多不饱和脂肪酸，在低温下仍可维持膜流动性。2.嗜高温微生物在高温条件下生长原因是：其酶和其它蛋白质在高温时更稳定；其蛋白质合成机构和细胞质膜（富含饱和脂肪酸等）等结组成份是热稳定。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第49页3.微生物耐热性在实践中主要性：发酵生产优点是发酵周期短，效率高；有利于非气体物质在发酵液中扩散和溶解，以及预防杂菌污染；可节约冷却发酵热量所需成本。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第50页二、pH1.pH影响微生物生长原因：介质pH影响生活环境中营养物质可给态和有毒物质毒性；影响菌体细胞膜带电荷性质、膜稳定性及膜对物质吸收能力；使菌体表面蛋白变性或水解。

2.分类：嗜酸性微生物（<pH5.4）嗜中性微生物（pH5.4～pH8.5）嗜碱性微生物（pH7.0～pH11.5）抗生素产生菌的菌种筛选及优化第51页3.嗜酸或嗜碱微生物耐酸或耐碱原因：主要是因为细胞本身含有维持胞内pH值靠近中性能力。嗜酸微生物在酸性环境中，细胞膜能够阻止H＋进入胞内、不停将胞内H＋排出胞外。而嗜碱或耐碱微生物，则能够阻止OH-进人胞内并将其排出胞外，以维持胞内靠近中性pH。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第52页工业菌种育种方针工业菌种育种：是利用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目标菌株进行多方位改造。经过改造，可使现存优良性状强化，或去除不良性质或增加新性状。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第53页工业菌种育种方法诱变基因转移基因重组抗生素产生菌的菌种筛选及优化第54页育种过程包含以下3个步骤：

(1)在不影响菌种活力前提下，有益基因型引入。(2)希望基因型选出。(3)改良菌种评价(包含试验规模和工业生产规模)。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第55页选择育种方法时综合考虑原因

(1)待改良性状本质及与发酵工艺关系(如批式或连续发酵试验)；

(2)对这一特定菌种遗传和生物化学万面认识明了程度；

(3)经济费用。假如对特定菌种基础性状及其工艺知晓甚少，则多半采取随机诱变、筛选及选育等技术：假如对其遗传及生物化学方面性状已经有较深认识，则可选择基因重组等伎俩进行定向育种。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第56页工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢路径中限速步骤：经过增加特定基因拷贝数或增加对应基因表示能力来提升限速酶含量；在代谢路径中引伸出新代谢步骤，由此提供一个旁路代谢路径。

(2)增加前体物浓度。

(3)改变代谢路径，降低无用副产品生成以及提升菌种对高浓度有潜在毒性底物、前体或产品耐受力。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第57页(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品能力。(6)消除代谢产品反馈抑制。如诱导代谢产品结构类似物抗性。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第58页

提升特定基因表示水平(1)引入强转录及翻译信号，可经过在一高效表示载体上克隆靶基因；在靶基因上游引入强开启子；修改现有表示信号，提升基因效力等。(2)诱导解除基因表示抑制突变。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第59页

改进菌种生长期有效率提升菌株对底物利用率方法：

a.经过确定并改变代谢中耗能个别;b.由另一菌株高效低能代谢路径代谢来实现。

c.赋予菌种对各种底物，尤其是价廉而丰富底物利用能力，由此可降低操作费用。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第60页诱变育种以微生物自然变异作为基础生产选种机率并不很高，一个基因自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础育种，是迄今为止我国外提升菌种产量、性能主要伎俩。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第61页诱变物理、化学或生物诱变方法抗生素产生菌的菌种筛选及优化第62页

一、诱变剂和诱变处理

物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理原因中当前使用得最方便而且十分有效是紫外线。许多高产菌株选育都用过紫外线，对于普通试验室、中小型工厂都适用，也很安全。其它几个射线都是电离性质，有一定穿透力，普通都由专业人员在专门设备中使用，不然有一定危险性。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第63页化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效是烷化剂。使用化学诱变剂优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第64页2、化学诱变剂是很经济，因为只需要少许适当诱变剂，设备是试验室普通玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大个别诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常慎重，要防止化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有些人对一些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第65页诱变剂选择1．碱基类似物和羟胺含有很高特异性，但极少使用，回复突变率高，效果不大。2．亚硝酸和烷化剂应用范围较广，造成遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小诱变剂之一。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第66页3．吖啶类诱变剂能够造成生化代谢路径完全中止。4．紫外线十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤最好诱变剂，它能造成不可回复缺突变。但它可能影响邻近基因性能。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第67页二、诱变育种步骤出发菌株选择处理菌悬液制备诱变处理中间培养分离和筛选抗生素产生菌的菌种筛选及优化第68页(一)出发菌株选择1．自然界新分离野生型菌株，对诱变处理较敏感，轻易到达好效果。2．在生产中经生产选种得到菌株与野生型较相像，也是良好出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提升菌株，往往屡次诱变能积累较多提升。4．出发菌株开始时能够同时选2～3株，在处理比较后，将更适合出发菌株留作继续诱变。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第69页5．要尽可能选择单倍体细胞、单核或核少多细胞体来作出发诱变细胞，这是因为变异性状大个别是隐性，尤其是高产基因。

6．依据采取诱变剂或依据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期细胞：有作用于休止期，就可选取孢子。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第70页

(二)处理菌悬液制备这一步骤关键是制备单细胞和单孢子状态、活力类似菌悬液，为此要进行适当培养基培养，并要离心，洗涤，过滤。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第71页(三)诱变处理

依据前面相关诱变剂及诱变处理介绍，结合诱变对象实际，设计诱变处理方案。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第72页

(四)中间培养

因为在发生了突变还未表现出来之前，有一个表现延迟过程，即细胞内原有酶量稀释过程(生理延迟)，需3代以上繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后筛选和取得稳定菌株都是极为主要。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第73页

方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯变异细胞。这么，隐性变异就会显现出来，若不经液体培养基中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果不稳定和未来菌株退化。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第74页(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以快速筛出大量到达初步要求分离菌落为目标，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以准确度为主。所以在详细方法上就有差异.

比如初筛能够在平皿上直接以菌落代谢产物与一些染料或基质作用形成变色圈或透明圈大小来挑取参加复筛者，而将90%菌落淘汰。在数量降低后就要仔细比较参加复筛和再复筛菌株，最终才能选得优异菌株。在以后复筛阶段，还应不停结合自然分离，纯化菌株。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第75页紫外线诱变育种

紫外线诱变普通采取15W紫外线杀菌灯，灯与处理物距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，普通为几秒至几十分钟。普通咱们常以细胞死亡率表示，希望照射剂量死亡率控制在70～80%为宜。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第76页

被照射菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。因为紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。因为紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后处理应在红灯下进行。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第77页(二)操作步骤

1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2．将菌悬液放入一巳灭菌，装有玻璃珠三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，普通处于浑浊态细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第78页3．取2～4m1制备菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，防止白炽光。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第79页

4．取未照射制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第80页亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈诱变作用。其准确作用机制尚不很清楚，据认为是伴伴随重氮甲烷生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG诱变作用随pH升高而增强。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第81页(二)操作步骤

1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，马上经过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。

2．MNNG溶液制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第82页3．诱变处理吸收MNNG溶液lml，加入到1ml孢子悬液中，30℃振荡30min，马上稀释1000倍停顿作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃3天后计数。

4．死亡率计算将未处理孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐层稀释分离，30℃下培养3天。依据处理前后活孢子数可计算出死亡率。

5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．抗生素产生菌的菌种筛选及优化第83页营养缺点型选育营养缺点型是指经过诱变而产生缺乏合成一些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等能力，必须在其基础培养基中加入对应营养成份才能正常生长变异株。与营养缺点型对应是野生型。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第84页能满足野生型菌株正常生长培养基称基础培养基(MM)；在基础培养基中加入对应营养成份称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺点型生长称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第85页营养缺点型用途

营养缺点型在生产上和科学研究上用途很大。当前生产氨基酸、核苷酸菌种都是各种类型缺点型。要研究代谢路径，育种技术都必须有营养缺点型菌株为材料。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第86页筛选营养缺点型步骤诱变淘汰野生型检出缺点型确定生长谱抗生素产生菌的菌种筛选及优化第87页一、诱变方法物理诱变化学诱变抗生素产生菌的菌种筛选及优化第88页二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺点型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺点型无法生长，仍处于休眠状态。因为细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就对应加入一定量抗生素，结果活化状态野生型就被杀死，保留了缺点型。普通细菌能够采取青霉素，酵母可采取制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺点型孢子却因未发芽而不能滤过。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第89页

三、检出缺点型原理：在固体基础培养基和完全培养基上，生长情况完全不一样，缺点型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。详细方法：影印法、点种法、夹层法抗生素产生菌的菌种筛选及优化第90页1．将一较平皿直径小1cm金属圆筒蒙上一层灭菌丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2．将完全培养基上长出全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标识方位。3．将基础培养基平皿和完全培养基平皿在标识同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

(一)影印法抗生素产生菌的菌种筛选及优化第91页4．将CM和MM在恒温箱中培养。5．二平皿相同方位进行比较，即可发觉在MM平皿上长出菌落少于GM平板上。MM上未长而对应于CM上长出那几个菌落就可能是缺点型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第92页

(二)点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在对应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第93页

(三)夹层法先在培养皿上倒一层基础琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现菌落标识，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出菌落就可能是缺点型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺点型菌落从夹层中挑出并不很轻易。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第94页四、营养缺点型生长谱确实定

验证确定是缺点型后，就需确定其缺点因子，即生长谱测定。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第95页生长谱测定方法将缺点型菌株培养后，搜集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿5～6个区间放上不一样营养组合混合物或吸饱此组合营养物滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。1个平皿测一个菌。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第96页以不一样组合营养混合物与融化凉至50℃MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺点型菌株于各对应位置，培养后依据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第97页基因育种基因重组育种：是利用体外DNA各种操作或修改手法取得目标基因，再借助于病毒、细菌质粒或其它载体，将目标基因转移至新宿主细胞并使其在新宿主细胞系统内进行复制和表示，或者经过细胞间相互作用，使1个细胞优异性状经其间遗传物质交换而转移给另1个细胞方法。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第98页一个完整基因克隆过程包含以下步骤１、取得待克隆DNA片段（基因）；２、目标基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、判定阳性重组子；５、重组子扩增与／或表示。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第99页2.2基因重组抗生素产生菌的菌种筛选及优化第100页一、质粒特点1、质粒存在并非微生物生命活动必需。2、每个细胞中存在质粒数称为该质粒拷贝数。不一样类型质粒其拷贝数各异，同一质粒在不一样条件下，拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种。3、质粒DNA分子常展现三种形态；常见一个是共价、闭环状DNA(CCCDNA)；其次是因为1条链有缺口而产生开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生线性DNA。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第101页质粒载体抗生素产生菌的菌种筛选及优化第102页二、各类质粒所赋予宿主细胞不一样表现型

抗生素抗性：抗生素产生；大肠杆菌素产生；肠毒素产生；复杂有机化合物降解；限制性核酸内切酶和修饰酶产生；杀伤性能。在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相同方式在宿主间相互转移。在试验室条件下，质粒也可经人工伎俩将其转化入宿主细胞内。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第103页三、质粒DNA提取方法细菌培养和质粒扩增；细菌收获和裂解；质粒DNA提取。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第104页四、遗传转化

转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离DNA片段，将其同源个别进行碱基配对，组合到自己基因中，从而取得供体细胞一些遗传性状。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第105页(二)操作步骤：质粒DNA转化感受态大肠杆菌1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml肉汤培养基中，37℃培养过夜。2．取0.5ml培养物接入50ml肉汤中，无菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振荡培养。3．将0.1mol／LCaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第106页4．当培养物A600在0.5～0.8左右时，开始收获细胞(大约需2～2.5h)．5．将培养物置冰浴中冷却10min。6．取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第107页7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min离心10min，弃去上清液．9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保留。10．加入1～20μl待转化质粒DNA溶液。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第108页11．在冰上放置20min，在37℃处理2min。再插入冰中，加入0.9m1肉汤37℃静置培养90min。12．以不一样量涂布选择培养基平板。13．于37℃培养过夜。判定转化菌落。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第109页常见遗传转化系统1、自然系统2、人工诱导（完整细胞）（1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++辅助噬菌体，Tris+Ca2+（2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）冻融系统（4）Triton处理：人工诱导（PEG/原生质体）抗生素产生菌的菌种筛选及优化第110页重组DNA中常见工具酶包含限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第111页限制性内切酶切开DNA分子所需酶：每一个酶都有其各自作用位点。常见限制性内切酶种类及特征W.Arber,H.O.Smith抗生素产生菌的菌种筛选及优化第112页限制性内切酶剪切方式抗生素产生菌的菌种筛选及优化第113页粘性未端：切开后两段DNA各留下一个尾，这2个尾核苷酸次序完全一样，中是方向相反。它们之间是互补，在适当条件下能够再连接一起。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第114页其它工具酶连接酶T4DNA修补工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶人工加polyA或polyT尾反转录酶抗生素产生菌的菌种筛选及优化第115页载体－宿主系统载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表示DNA；普通是经过改造质粒、噬菌体或病毒等构建。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第116页载体应具备以下条件：１、能在适当宿主细胞中复制；２、含有各种限制酶单一切点（即所谓多克隆位点）方便外源DNA插入；３、含有筛选标志以区分阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，方便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表示型载体还应含有与宿主细胞相适应开启子、增强子、加尾信号等基因表示元件。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第117页宿主细胞必须符合以下条件１、对载体复制和扩增没有严格限制；２、不存在特异内切酶体系降解外源DNA；３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；４、重组缺点型，不会产生体内重组；５、轻易导入重组DNA分子；６、符合重组DNA操作安全标准。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第118页目标基因获取一、经过建立基因文库分离靶基因基因文库包含两类：基因组文库：利用限制性内切酶。cDNA：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表示内含子。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第119页二、化学合成法制备DNA片段从蛋白质肽链氨基酸次序能够知道它遗传密码，再依照密码合成基因。三、聚合酶链反应法扩增基因片段对于已知全部或个别核苷酸序列基因，能够经过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目标基因片段。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第120页PCR技术依据需扩增片段两端设计引物。使DNA解链（高温），引物结合于基因两端（低温），在适当温度下开始合成（链延长）反应。特点：需要极少DNA模板，且能直接从基因组中得到目标基因。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第121页DNA扩增PCR反应抗生素产生菌的菌种筛选及优化第122页DNA片断克隆载体条件a复制起点b适宜限制酶切点c选择标识抗生素产生菌的菌种筛选及优化第123页

DNA分子体外连接

DNA片段体外连接是重组DNA技术关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第124页一、DNA连接酶DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体DNA连接酶。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：１、连接含有同源互补粘性末端ＤＮＡ片段；２、连接双链DNA分子间平端；３、在双链平端DNA分子上添加合成人工接头或适配子。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第125页重组DNA导入宿主菌

体外连接重组DNA分子必须导入适当受体细胞中才能大量复制、增殖和表示。依据所采取载体性质，将重组DNA分子导入受体可有不一样方法。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第126页一、转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞过程。转化时，细菌必须经过适当处理使之处于感受态－即轻易接收外源DNA状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。另外还可用电穿孔法转化细菌，它优点是操作简便、转化效率高、适合用于任何菌株。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第127页二、转染和感染

利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一个是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一个方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成重组子导入细胞过程统称为转染。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第128页重组克隆筛选与判定

基因克隆最终一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子菌落，并判定重组子正确性。经过细菌培养以及重组子扩增，取得所需基因片段大量拷贝。深入研究该基因结构、功效，或表示该基因产物。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第129页一、抗药性标志筛选

假如克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr，转化后只有含这种抗药基因转化子细菌才能在含该抗菌素平板上幸存并形成菌落，这么就可将转化菌与非转化菌区分开来。假如重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，经过有没有抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）转化菌落。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第130页二、β－半乳糖苷酶系统筛选

很多载体都携带一段细菌lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端146个氨基酸，称为α－肽，它表示β－半乳糖苷酶C-端肽链。当载体与宿主细胞同时表示两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异底物X-gal变为兰色化合物，这就是所谓α－互补。而重组子因为基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal平板上，含阳性重组子细菌为无色菌落或噬菌斑。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第131页三、菌落快速裂解判定法从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有没有插入片段存在，该法适于插入片段较大重组子初筛。四、内切酶图谱判定经初筛判定有重组子菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用对应内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入重组子，还要用内切酶消化判定插入方向。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第132页重组DNA判定遗传学方法抗生素产生菌的菌种筛选及优化第133页杂交育种抗生素产生菌的菌种筛选及优化第134页

(一)细菌杂交在细菌中实现杂交种类尚不多，主要是大肠杆菌，其它还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质一定位置上(Hfr细胞)。F因子有显著感染性，大肠杆菌接合，实质上是F因子转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第135页（二）酵母杂交育种技术1、酵母繁殖方式酵母为单细胞型真菌，普通以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第136页单倍体细胞具α及ε2两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子存在而不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还能够形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第137页2、酵母杂交普通而言，杂交育种利用了酵母单双倍生活周期，将不一样基因型和相正确交配型单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可取得新遗传性状。酵母杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，利用罕见交配法更易取得结果。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第138页原生质体育种

原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，另外还有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组一个主要方法。原生质体融合作为一个新基因重组伎俩是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第139页

一、原生质体融合育种特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形原生质体。(二)受接合型或致育型限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体作用，所以有利于不一样种属间微生物杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株细胞质和细胞核进行类似合二为一过程。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第140页

(四)存在着两株以上亲株同时参加融合形成融合子可能性。（五有可能采取产量性状较高菌株作融合亲株。

(六)提升菌株产量潜力较大。

(七)有利于建立工业微生物转化体系。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第141页二、原生质体融合育种步骤1．标识菌株筛选和稳定性验证。2．原生质体制备。3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4．涂布于再生培养基，再生出菌落。5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子深入试验、保藏。6．生产性能筛选。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第142页

三、原生质体融合育种关键点（一）标识菌种选择取得标识菌种方法是采取常规诱变育种，筛选出营养缺点型或／和抗药性菌株。这里最主要是标识必须稳定。采取抗药性菌株除可作标识外，在试验室中还可排除杂菌污染干扰。为是确证融合成功，能够采取多标识菌种。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第143页

(二)原生质体制备

原生质体制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住类似球状细胞，它保持原细胞一切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采取溶菌酶；酵母和霉菌普通可用蜗牛酶或纤维素酶等。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第144页

影响原生质体制备原因1．菌体前处理为了使酶作用效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量青霉素。2．菌体培养时间为了使细胞易于原生质体化，普通选择增殖期菌体。3．酶浓度对于不一样种属微生物，不但对酶种类要求不一样，就是对酶浓度也有差异。另外，最正确酶浓度还随不一样生长久菌体而改变。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第145页4．酶处理温度5．破壁时pH值6．渗透压稳定剂等渗透压在原生质体制备中，不但起到保护原生质体免于膨裂，而且还有利于酶和底物结合，渗透压稳定剂多采取甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第146页筛选新代谢产物

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第147页一、开发新代谢产物路径

(1)从自然界分离新微生物菌株，或采取新检阅方法筛选新代谢产物。(2)对已知微生物代谢产物进行化学修饰。(3)利用微生物转化改造代谢产物结构。(4)经过原生质体融合取得新代谢产物。(5)DNA重组技术。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第148页二、筛选微生物新代谢产物

程序

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第149页抗生素产生菌的菌种筛选及优化第150页突变型菌株筛选

一、产量性状突变株筛选抗生素产生菌的菌种筛选及优化第151页

三、筛选微生物代谢产物目标

筛选克服抗生素抗性菌株活性物质；筛选抗肿瘤、抗病毒活性物质；研究有药理活性酶抑制剂及免疫调整剂；寻找食品工业最好酵母培养物；筛选降解有害物质微生物以及治疗上含有低毒、长期有效化学药品等。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第152页四、筛选微生物代谢产物方法

(一)直接方法为了尽快确定微生物代谢产物利用前途，在体外试验测得活性后，能够将培养液有效成份直接作用于机体，观察被测样品疗效。这种直接确定代谢产物用途方法亦称动物体内治疗试验。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第153页抗生素产生菌的菌种筛选及优化第154页

(二)间接方法筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质。在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法。经过预筛选，直接测定最初分离物生物活性，能加速筛选过程。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第155页

五、检测系统

筛选过程成功依赖于排除那些已知或并非需要代谢产物检验方法，这么才能识别出大家需要化合物。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第156页性能签别

性能判别是分离和筛选微生物代谢产物中最基础工作。判别可分为两方面：一是对微生物方面进行形态、培养、生化功效答试验观察，并确定微生物产生菌类群；

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第157页

二是从化学早期判别来判别微生物代谢产物。化学早期判别普通对产生菌所产生代谢产物进行纸上层析、薄板层析、纸上电泳、抗茵谱、高压电泳、紫外分光光度法、液相和气相色谱等试验，井取得各种图谱，与已知图谱进行比较判别。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第158页假如认为是有实用前途代谢产物，则要深入大量培养，并进行动物试验、毒性考查、药品代谢等试验，并进行提升发酵水平和改进提取工艺工作，以备投入生产。假如是新代谢产物．普通要深入确定其化学结构，井在此基础上进行合成法研究或进行化学改造，研究结构与生物活性相互关系，并对作用机制、生物合成过程作深入研究。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第159页

菌种筛选方法

诱变处理后，突变细胞只占存活细胞百分之几，而能使生产情况提升细胞又只是突变细胞中少数。

为了花费最少工作量，在最短时间内取得最大筛选成效，就要求采取效率较高科学筛选方案和伎俩。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第160页菌种筛选方案

初筛：目标是删去明确不符合要求大个别菌株，把生产性状类似菌株尽可能保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测定准确性还在其次。初筛伎俩应尽可能快速、简单。复筛目标是确认符合生产要求菌株，所以，复筛步骤以质为主，应准确测定每个菌株生产指标。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第161页菌种筛选伎俩

初筛从菌体形态变异分析平皿快速检测法

详细有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。

初筛摇瓶培养普通是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%很好菌株，淘汰80-90%菌株；而复筛中摇瓶培养普通是一个菌株培养3瓶，选出3-5个很好菌株，再做深入比较，选出最正确菌株。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第162页特殊变异菌筛选方法

营养缺点型突变株筛选

经诱变处理后菌悬液在筛选前普通应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，预防出现表型延迟现象，筛选出不纯菌株。营养缺点型筛选普通包含浓缩、深入检出和判别营养缺点型等步骤。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第163页抗性突变菌株筛选

抗性突变株筛选相对比较轻易，只要有10-6频率突变体存在，就轻易筛选出来。抗性突变株筛选常见有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种伎俩。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第164页

一次性筛选法

噬菌体抗性菌株、耐高温菌株阶梯性筛选法药品抗性突变株。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第165页组成酶变异株筛选

许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶生产不但需要诱导物，而且受到诱导物种类、数量以及分解产物影响。详细筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第166页1)

恒化器法：常被用于微生物“驯化”。在培养基中添加不能起诱导作用低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成相关酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提升组成酶变异株优势，即它在群体中百分比，能够应用恒化器培养技术。伴随恒化器培养中不停加入新鲜基质而逐步增大组成酶变异株优势，这么就能够比较轻易地做深入纯化分离。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第167页2)

循环培养法：利用不含诱导物培养环境和含有诱导物培养环境进行交替循环培养待分离菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源培养基中时，两种类型菌株一样能很好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成相关水解酶，而诱导型菌株就不能合成。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第168页

将它们转接入含诱导物培养基中时，变异株能快速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶阶段，两类菌株生长就不一样时，组成酶变异株所占百分比将逐步增大。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第169页3)

诱导抑制剂法：有些化合物能阻止一些诱导酶合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第170页工业微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，含有高产有主要经济价值某一期待代谢产物主能力微生物菌种保留和长久保藏，对于一成功工业发酵过程极为主要。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第171页一、理想菌种保藏方法应具备条件(1)

经长久保藏后菌种存活健在；(2)

确保高产突变株不改变表型和基因型，尤其是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产高产能力。(3)菌种保藏基础办法是低温、干燥、真空。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第172页二、工业微生物菌种保藏技术

(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；

(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；

(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第173页2.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种最简单而有效方法。经过冷冻，使微生物代谢活动停顿。普通而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了取得满意冷冻结果，通常应在培养物中加入一定冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏缺点之一是培养物运输较困难。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第174页冷冻保藏种类

一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第175页普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保留。用此方法能够维持若干微生物活力1—2年。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第176页应注意是经过一次解冻菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不宜多数微生物长久保藏。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第177页二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长久保藏微生物菌种，普通都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种普通方法是：

1．离心收获对数生长中期至后期微生物细胞；

2．用新鲜培养基重新悬浮所收获细胞；

3．加入等体积20％甘油或10％二甲亚砜；

4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第178页假如待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱冷冻速度普通控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可经过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第179页三、液氮冷冻保藏技术

(一)冷冻保护剂

在液氮冷冻保藏中，最常见冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度普通为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第180页(二)液氮冷冻保藏微生物菌种步骤

1．待冷冻保藏菌种悬液制备

(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，

抗生素产生菌的菌种筛选及优化第181页(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，假如菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将全部封好安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间到达平衡。抗生素产生菌的菌种筛选及优化第182页2．控速冷冻．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机冷冻室中；(3)以1-2℃/min致冷速度降温，直到温度到达相对温度之上几度细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；抗生素产生菌的菌种筛选及优化第183页(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿快速移入液氮罐中于气相(-96℃)或液相(-156